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如何校准生化分析仪
核心提示：一个实验室测定结果的可靠性是由其精密度、准确性及可比性所决定的，一般必需从下面几方面着手。一． 选好测定方法；二． 购买质
&一个实验室测定结果的可靠性是由其精密度、准确性及可比性所决定的，一般必需从下面几方面着手。
一． 选好测定方法；
二． 购买质量过硬的试剂盒；
三． 要有质优的测试仪器；
四． 必需进行正确的校准；
五． 还要规范化操作；
六． 搞好过硬的室内质量控制；
七． 积极参加室间质评活动；
八． 还要有一支素质高的队伍。
&&& 现就生化分析仪的校准问题提出个人看法。
一、 校准的重要性和必要性
&&& 首先必须明确生化分析仪不论如何先进，它还是一个比较器，它测试出来的标本结果是随着标准限的设置不同而变化的。所以，在卫生部临床检验中心拟定的&临床实验室（定量测定）室内质控工作指南&中明确指出&对测定标本的仪器一定要求进行校准，校准时要选择合适的（配套的）标准品/校准品；如有可能，校准品应能溯源到参考方法或/和参考物质；对不同的分析项目要根据其特性确立各自的校准频率。&这说明校准仪器是室内质控的重要部分，强调了校准工作的必要性和重要性，同时指出了校准的方法和要求。
二、 确立测定系统的概念
&&& 对于一个临床检测项目，如果所用方法的测定原理、试剂、仪器、校准品中任何一个不同，都可能得到不同的测定结果。因此，测定系统包括测定原理、试剂、仪器、校准品四要素。如果我们想要得到准确可靠的测定结果，而该结果又具有与国际、国内其他实验室的可比性，应该自己建立一个标准测定系统。在全自动生化分析仪上使用配套的试剂和标准品，即日立7170使用宝灵曼的试剂和校准品（c.f.a.s），在贝克曼CX-7生化分析仪上使用贝克曼的试剂和校准品等。各仪器厂家均有自己的标准测定系统。对于校准品不能乱用，如绝对不能用贝克曼的校准品校准日立生化仪，同样也不能用宝灵曼的校准品去校准贝克曼生化仪。
三、 校准品和质控品
&&& 校准品（Calibration materials）含有已知量的欲测物，用以校准该测定方法的数值，它与该方法及试剂、仪器是相关联的。校准品的作用是为了减少或消除仪器、试剂等造成的系统误差。因此最好为人血清基质，以减少基质效应造成的误差。
&&& 质控品（Control materials）只用于和待测标本同时测定的，为了控制标本的测定误差，因此要求保存时间十分稳定。前者是校准其值而后者是控制误差用的。
四、 校准前准备
&&& 1 .了解灯泡已使用多久？检查飘移是否合乎要求；
&&& 2． 检查比色杯的清洁及磨损情况？必要时进行更换；
&&& 3． 用清洁剂泡洗管道
&&& 4． 测定仪器的精密度及线性是否达到仪器性能要求？
五、 定值质控血清是否可以校准仪器？
&&& 我们在相同条件下，同时用五个进口产品，每家两种不同浓度的定值如TP、ALB、UREA、UA、ALP、GGT、CK、HBDH、LD、AMY等，在日立7170A上进行测定(用常规试剂)，详见质控血清对部份常规测定项目（如T、ALB、UREA、Cr、UA、K、Na、Cl、AST、ALT）结果与靶值比较：
表& 不同厂家定值质控对TP、ALB、、AST、ALP结果与靶值比较
&&&&&&&&&&&&&&&&&&& TP ALB UREA AST ALP&
&&&&&&&&&&&&&&&&&& T 偏差% T 偏差% T 偏差% T 偏差% T 偏差%&
汽巴康宁1 57 4.39 29 0 5.0 4.5 43 -10.5 96 4.2&
汽巴康宁2 46 4.89 24 2.08 19.3 -5.76 184 -11.7 265 0.2&
宝灵曼1 50 2.0 34.8 -5.17 8.96 0.45 58.3 -11.2- 242 2.7&
宝灵曼2 48.6 2.88 33.7 -5.04 24 -6.77 140 -12.3 384 2.7&
RANDOX1 59.7 6.36 40.8 3.88 7.67 4.3 62 -17.7 214 -16.1&
RANDOX2 39 8.33 26.9 5.98 21.6 -5.67 144 -12.7 394 -17.1&
Human1 72 4.18 46.7 -4.18 3.78 5.16 33.5 -7.5 168 -2.2&
Human2 29.8 -2.68 29.8 -2.76 25.1 -5.08 151 -11.7 287 -9.1&
Bio-Red1 63 0 39 1.28 7.1 0 24 -14.6 25 22&
Bio-Red2 42 1.79 27 0 18.0 -4.44 201 -14.3 298 0.84&
* 从总蛋白结果来看RANBOX与Bio-Red 相差为6.45%，而宝灵曼与Bio-Red 较为接近；
* 从白蛋白结果分析，宝灵曼与Bio-Red相对相差5.75%，与总蛋白结果明显不同。Bio-Red则与汽巴康宁比较接近。
* UREA结果中凡是高值均上不去，分析其原因很可能与我们采用试剂盒的质量有关，所以试剂盒的线性范围理应成为选择试剂盒的重要依据之一。但从低值结果分析，也有5%的偏差（Bio-Red与Human）
* AST与ALT测定值均低于靶值，这就涉及我们选用什么K值问题。
* ALP测定中RANDOX（-16.6%）与宝灵曼（2.7%）靶值之间竟相差19.3%，这可能涉及试剂盒选用缓冲液种类，PH值以及所用&值等有关。
&&& 通过上述结果比较，说明不同厂家生产的定值质控血清靶值之间有的相差较大，提示我们决不能用定值质控血清代替校准品作校准用。
六、 校准方法
&&& 例如日立(Hitachi)系列您必须购买宝灵曼(Boehringer)的试剂及其校准的说明书设置参数，用c.f.a.s.校准血清进行校准，即可获得各项目的校准K值，同时观察一下各项目测定时反应进程图，检查各项目参数设置是否在最佳位置，如不在最佳位置应予以重新设置并测定。此时得到的K值即为准确的校准K值，然后测定待测的10至20份新鲜血清三次取其平均值，应该说此结果是用Hitachi-Boehringer检测系统所获的测定值。然后用此血清值校准其它测定系统。
表& 日立7170、BM试剂连续四个月每天进行校正(n=81)K值的变化
&&&&&&&&&& TP ALB ALT AST Crea Urea UA TG Chol Glu Ca CK GGT&
&SD& 86 6.69& 63 49.7&
16.1 16.9 17.4 18.4 56.8 61.11 67.9&
CV%& 2.8& 1.0& 2.1& 1.7& 9.8& 1.9& 1.1& 1.4& 1.2& 1.0 9.6& 1.6& 6.9
七、 关于酶活性测定校准问题
&&& 有的主张不进行校准而采用固定K值，有的作者以为应该进行校准。酶活力计算公式如下：
&&&&& 酶活力（u/l）=△A/min&V&106/(&&v&1)
&&&&& 令k=V&106/（&&v）
&&&&& 则酶活力（u/l）=△A/min&k
&&& 常用K值有以下几种：
&&&&& a) 理论K值：根据理论摩尔消光系数（&）来计算，如NADH为6.22&103
&&&&& b) 实测K值：由于仪器波长的精密及半宽度不同，而应根据实测&值来设定K值
&&&&& c) 厂家给的K值：厂家生产试剂盒说明书上提供的K值（有的厂家提供6.3&103）
&&&&& d) 校准K值：通过校准物直接校准得到的K值
&&& 在日立7170A全自动生化分析仪上，可以得到几种不同的酶K值，见下表
表 日立7170A全自动生化分析仪上用不同方法得到几种酶的K值
指示物 波长 理论K值 实测K值 校准K值&
ALT NADH 340nm （8.1%） %）&
AST NADH 340mm （8.1%） %）
CK NADPH 340mm （8.1%） %）&
GGT 4NA 405mm （8.5%） %）&
GGT 4NB 405mm （17.9%） &&&
ALP 4NA（PH10） 405mm 757 825（8.9%） &&&
注：1校准物为宝灵曼c.f.a.s，试剂也用宝灵曼的配套试剂。
&&& 2括号内数字是该K值与理论K值相比的变化率
&&& 以上摘自张克坚文章中
* 从上述K值中不难发现实测K值大于理论K值，这说明生化分析仪的测光系统还存在着一定误差，如波长、半宽度及光径等偏差，使仪器达不到理论上的最佳状态；
* 校准K值与实测K值之间也存在一定的差距，即使指示物和仪器相同，其差异可能由试剂及校准品造成的；
* 作者认为最好使用校准K值，但必须由两个先决条件：1必须使用配套的试剂；2必须使用配套的高质量的校准品，但校准K值应有其溯源性。
&&& 关于酶活标准品，欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物，相信不久将会有公认的标准（校准）品问世。
八、 必须拟订校准计划（文件）
&&& 校准工作不是仅进行一次就可万事无忧一劳永逸，而必须经常化。按照&临床实验室质量控制（QC）的要求（草案）&必须要求拟定校准计划，其内容包括：
&&& 1．建立校准方法
&&&&& ⑴选择合适（配套）的校准品，包括校准品数目、类型和浓度；
&&&&& ⑵如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质；
&&&&& ⑶确定校准的频度。至少每六个月进行一次校准；
&&&&& ⑷如有下列情况发生时，必须进行校准
* 改变试剂的种类，或者批号更换了。如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的范围，则可以不进行校准；
* 仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件，这些都有可能影响检验性能；
* 质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时；
2．每个实验室对每台仪器必需要有校准计划。每次校准必须有详情的记录和分析。每次校准记录必须保存备查。
编辑：songjiajie2010
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临床生化检验与生化试剂.
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3秒自动关闭窗口o 短篇论著
探讨具有溯源性和互换性的校准品在临床生化应用中的重要性
: 526-528. DOI: 10.3760/cma.j.issn.16.07.013
探讨具有溯源性和互换性的校准品在临床生化应用中的重要性
[J].&中华检验医学杂志,2016,39(
): 526-528. DOI: 10.3760/cma.j.issn.16.07.013
基金 &关键词
English Abstract
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由于各试剂生产厂家选择的缓冲液的种类和浓度以及样本/试剂体积比不同，加之不同生化分析仪比色杯光径的精密度和反应槽恒温性能的不同，使得血清酶常规检测系统之间的结果有差异。不同试剂生产厂家校准品的制备不同，以及校准品赋值过程的不同，更是加大了检测结果间的差异。为使血清酶定量测定的结果具有可比性，国际临床化学和医学实验室联盟(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC)研究并建立多个酶学检测的参考方法，并研究开发参考物质等。但在大家都一味的强调这样的标准化的同时却忽略了校准品的互换性。著名的标准化专家Miller和参与ERM470参考物质制备的Zegers都提出了校准品互换性的重要性和目前仍存在的问题[,]。本实验室依据IFCC推荐的参考方法建立了GGT和LDH的参考测量程序并参加了国际室间质评，确保本实验室结果的准确性[,,]。本研究收集乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)、丙型肝炎抗体(Anti－HCV)、梅毒抗体(Anti－TP)、艾滋病毒抗原/抗体(HIVAg/Ab)全阴性混合血清，－80 ℃冻存。验证混合血清稳定性和互换性，并由4家酶学参考实验室联合赋值，制备成本研究所使用的参考物质。研究使用具有溯源性和互换性的参考物质作为校准品校准前后，参加试验的实验室间结果的正确度和一致性的变化，为进一步开展血清酶定量测定标准化工作提供实验数据。一、材料与方法1．研究对象：收集第四军医大学西京医院2014年7月至8月住院患者GGT和LDH项目高、中、低3个水平HbsAg、Anti－HCV、梅毒螺旋体抗体(syphilis TP)、HIVAg/Ab全阴性的新鲜混合血清配制成检测样本。用0.45 μm的滤膜过滤除掉血清中的颗粒，将混合血清混匀后分装到1.5 ml的冻存管于－80 ℃保存待用。GGT：高值200～300 U/L，中值100～200 U/L，低值50～100 U/L；LDH：高值300～1000 U/L，中值150～300 U/L，低值100～150 U/L。2．参加本研究的实验室：4家酶学参考实验室：西京医院，四川迈克生物科技股份有限公司，宁波美康生物科技股份有限公司和北京航天总医院。11家临床实验室：西京医院、唐都医院、西安交通大学第一附属医院、陕西省人民医院、西安市中心医院、西安医学院附属医院、陕西省妇幼保健院等。3．参考物质的制备：收集50 ml GGT中值混合血清，用0.45 μm的滤膜过滤除掉血清中的颗粒，将混合血清混匀后分装到1.5 ml的冻存管于－80 ℃保存。以同样的方法收集50 ml LDH中值混合血清过滤分装后－80 ℃保存。4．仪器设备：4家参考实验室：日立U－3310紫外分光光度计2台，安捷伦Cary100紫外分光光度计1台，岛津UV2450紫外分光光度计1台。11家临床实验室：日立全自动生化分析仪7600共3台，日立全自动生化分析仪7180共3台，罗氏全自动生化免疫分析仪Cobas8000共2台，奥林巴斯5800共3台。5．稳定性和互换性验证：(1)稳定性评估：每季度对GGT和LDH三个水平的混合血清进行检测，评估1年内检测结果的稳定性。(2)互换性验证：收集GGT和LDH临床标本各20份，浓度尽可能覆盖高中低浓度，分别将各个项目的20份标本和要验证的参考物质在临床实验室(用酶学参考实验室赋值的参考物质校准)和参考实验室进行检测，将两组数据进行直线回归，绘制常规方法对于参考方法的95%的置信区间，判断参考物质的测定值是否落在95%的置信区间内。参考物质的测定值落在95%的置信区间内，说明互换性良好。6．参考物质酶学参考实验室联合赋值：由4家参加国际酶学实验室室间比对活动5年以上且成绩合格的实验室对GGT和LDH混合血清进行检测，为混合血清赋值。7．参考物质作为校准品在临床的应用：参加试验的11个实验室先使用各自配套的GGT和LDH的校准品，在校准通过后，将各个项目低中高3个水平的血清样本和参考物质各测定3次，记录检验结果；再使用具有溯源性和互换性的GGT和LDH的参考物质作为校准品分别对GGT和LDH项目进行校准，校准后重复测定每个项目低中高3个水平的血清样本和参考物质各3次，记录检验结果。计算11家实验室在使用具有溯源性和互换性的参考物质作为校准品校准前后，参考物质检测结果与靶值的偏移和低中高3个水平的血清样本检测结果的变异系数(CV%)。8．结果统计：使用SPSS14.0软件对检测结果进行统计，使用Graphpad prism 5软件作图。二、结果1．参考物质稳定性验证：分别于2014年8月和11月，2015年3月和7月对混合血清GGT和LDH结果进行检测，结果稳定性良好。GGT检测结果均值为133.88 U/L，标准差(SD)为0.63 U/L，变异系数(CV)为0.47%；LDH检测结果均值为230.22 U/L，标准差(SD)为1.26 U/L，变异系数(CV)为0.55%，见。表1参考物质－80 ℃保存1年内检测结果的稳定性(U/L)表1参考物质－80 ℃保存1年内检测结果的稳定性(U/L)GGT133.00134.33134.33133.86133.880.630.47%LDH229.67229.33231.67231.84230.631.310.57%2．参考物质互换性评估：GGT和LDH两个项目的20份标本和要验证的参考物质在临床实验室(西京医院日立全自动生化分析仪7600检测系统)和参考实验室(西京医院酶学参考实验室)进行检测，将两组数据进行直线回归，绘制常规方法对于参考方法的95%的置信区间，参考物质的测定值落在95%的置信区间内。经验证GGT和LDH参考物质互换性良好，见和。图1GGT参考物质互换性验证图1GGT参考物质互换性验证图2LDH参考物质互换性验证图2LDH参考物质互换性验证3．酶学实验室联合赋值：此批参考物质由西京医院，四川迈克生物科技股份有限公司，宁波美康生物科技股份有限公司和北京航天总医院共4家酶学参考实验室联合赋值，待赋值的混合血清通过冷链运输到达各个酶学参比实验室。西京医院GGT参考物质检测结果是128.80 U/L，是4个酶学参考实验室检测结果最高的实验室，北京航天总医院参考物质检测结果是126.70 U/L,是4个酶学参考实验室检测结果最低的实验室，最高结果和最低结果相差2.10U/L，GGT参考物质检测结果均值127.71 U/L, SD 0.92 U/L, CV 0.72%，实验室间检测结果的CV很小；西京医院LDH参考物质检测结果是228.91 U/L，是4个酶学参考实验室检测结果最高的实验室，四川迈克参考物质检测结果是225.70 U/L,是4个酶学参考实验室检测结果最低的实验室，最高结果和最低结果相差3.21 U/L，GGT参考物质检测结果均值226.95 U/L, SD 1.52 U/L, CV 0.67%，实验室间检测结果的CV很小，见。表24家酶学参考实验室对参考物质的赋值结果(U/L)表24家酶学参考实验室对参考物质的赋值结果(U/L)GGT128.80128.09127.26126.70127.710.920.72%LDH228.91225.70227.40225.80226.951.520.67%4．参考物质在临床的应用：11家实验室先使用各自配套的GGT和LDH校准品校准仪器，校准通过后检测参考物质。GGT参考物质检测结果的均值128.54 U/L，检测结果与靶值的偏移0.66%；LDH参考物质检测结果的均值217.65 U/L，检测结果与靶值的偏移－4.10%。使用了具有溯源性和互换性的参考物质作为校准品校准后，GGT参考物质检测结果的均值128.08 U/L，检测结果与靶值的偏移0.30%；LDH参考物质检测结果的均值227.49 U/L，检测结果与靶值的偏移0.23%。使用具有溯源性和互换性的参考物质参后，GGT参考物质检测结果与靶值的偏移由0.66%降到0.30%, LDH参考物质检测结果与靶值的偏移由－4.12%降到0.21%，见。表3使用具有溯源性和互换性的参考物质作为校准品校准前后偏移的变化(U/L)表3使用具有溯源性和互换性的参考物质作为校准品校准前后偏移的变化(U/L)GGT127.70128.540.66%128.080.30%LDH226.95217.65－4.10%227.490.23%三、讨论近年来，随着酶学检测标准化程序的建立，致力于标准化研究的专家也越来越多，人们探索着如何将参考物质或参考方法的可靠性通过溯源链传递给检测系统的校准品，常规实验室使用具有溯源性的校准品，使患者样品的检测得到可溯源的结果，实现患者样品检测结果的世界大同[]。但是，如果不认识到参考物质还需要具备互换性的话，一致性将无法实现，更无法谈及实现溯源性[]。国外有学者对参考物质互换性做了一些研究，Carobene等[]以GGT为例评估了参考物质的互换性，Perich等[]在欧洲多个实验室也做了类似的研究。国内也有学者研究质控品和校准品的互换性[]。但制备与血清基质一致的具有溯源性和互换性的参考物质并应用于临床的研究却较少。有些校准品是血清基质的，但不是添加了防腐剂就是为了使这样的参考物质在冻融时不会出现浑浊而事先去除了血清中的α脂蛋白。最终引入了更多的处理和去除更多原血清中的成分使这样的参考物质与新鲜患者血清的互换性遭遇了严重问题。本研究收集新鲜混合血清去除杂质后分装，验证混合血清的稳定性和互换性后由4家酶学参考实验室联合赋值，最后在临床应用。使用具有溯源性和互换性的参考物质参后，检测结果与靶值间的偏倚降低了，实验室间结果的CV也降低了。在临床实验室使用具有溯源性和互换性的参考物质作校准品，能大大的提高实验室间结果的正确度和一致性，提高检测结果的准确性，有利于各个实验室各设备间结果的标准化和一致化。参考文献[1]MillerWG, MyersGL. Commutability still matters[J]. Clin Chem, 2013, 59(9): 1291–1293. .[2]Zegers1, BeethamR, KellerT, et al. The importance of commutability of reference materials used as calibrators: the example of ceruloplasmin[J]. Clin Chem, 2013, 59(9): 1322–1329.[3]SchumannG, BonoraR, CeriottiF, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. Part 3. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(6): 643–648.[4]SchumannG1, BonoraR, CeriottiF, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Part 6. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of gamma－glutamyltransferase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(7): 734–738.[5]张莹，周铁成，童开，等.酶学参考实验室室间质量评价技术方案的建立[J].现代检验医学杂志，2010, 25(3): 146–148. .[6]KuwaK．[Establishment of working reference materials in laboratory medicine][J]. Rinsho Byori, 2006, 54(9): 940–946.[7]Greg MillerW, MyersGL, Lou GantzerM, et al. Roadmap for harmonization of clinical laboratory measurement procedures[J]. ClinChem, 2011, 57(8): 1108–1110. .[8]CarobeneA, GuerraE, CeriottiF, et al. A mechanism－based way to evaluate commutability of control materials for enzymatic measurements. The example of gamma－glutamyltransferase[J]．Clin Chim Acta, 2013, 424(6): 153–158. .[9]PerichC, RicósC, AlvarezV, et al. External quality assurance programs as a tool for verifying standardization of measurement procedures: Pilot collaboration in Europe[J]. Clin Chim Acta, 2014, 432(11): 82–89. .[10]李民，王延伟，陈阵，等.几种α－淀粉酶校准品和质控品的互换性研究[J].临床军医杂志，2012, 40(4): 942–943. .
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出版日期：
收稿日期：
Importance of applying calibrators with traceability and commutability into clinical biochemical tests
Zhang&Ying,Zhou&Tiecheng,Tong&Kai
DOI: 10.3760/cma.j.issn.16.07.013
Cite as Chin J Lab Med, ): 526-528.
Contributor Information
Zhang&Ying
Zhou&Tiecheng
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