[请教] 溶菌酶破碎大肠杆菌(Escherichia coli)
20:29:05&&&来源：&&&评论：&&
[[请教] 溶菌酶破碎大肠杆菌(Escherichia coli)] 我打算做蛋白提取，以前单纯用超声效果不好，为了尽量保留活性，选择用溶菌酶见超声破碎的方法。
我按照分子克隆上的步骤：
1.菌体称重为0.4g，加PBS buffer 3ml （PH=8.05），充分混匀。
2.加现配的50mg/ml溶菌酶溶液240微升，至终浓度4mg/ml。冰置3小时。
3.超声400w，10s，10s，40次，结果目测还是乳白色，镜检很多菌体。为什么破不开，搞不懂，我前 关键词:[溶菌酶 大肠杆菌 菌体 蛋白提取 超声破碎 乳白色 分子克隆]…
我打算做蛋白提取，以前单纯用超声效果不好，为了尽量保留活性，选择用溶菌酶见超声破碎的方法。
我按照分子克隆上的步骤：
1.菌体称重为0.4g，加PBS buffer 3ml （PH=8.05），充分混匀。
2.加现配的50mg/ml溶菌酶溶液240微升，至终浓度4mg/ml。冰置3小时。
3.超声400w，10s，10s，40次，结果目测还是乳白色，镜检很多菌体。为什么破不开，搞不懂，我前几天做预实验的时候，还能变澄清？？？注：预实验的步骤与现在的一样，只是菌体重量是0.1g加PBS 3ml，再加溶菌酶至1mg/ml，超声400w，10s,10s, 20次。麻烦大家能给以帮助，先谢谢了...
破菌时，不要太在意所谓的乳白色、澄清之类的东东，也不要过分相信镜检。简单的方法就是电泳，破菌离心后做个上清和沉淀的电泳就行了。我们一般破菌（E.coli.），就是1g菌加10-20ml缓冲液，冰超声4s/4s，400-500W，99次*2，就可以了。你的溶菌酶加得太多了吧，我不知道具体用量，但4mg/ml肯定是过了。从纯化的角度看，加入了这么多杂蛋白，不可思议。
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[[请教] 溶菌酶破碎大肠杆菌(Escherichia coli)]延伸阅读：
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频道本月排行BCT 第四章 1
生物技術方法&
生物技術核心實驗&
． Chapter 4
Purification
and Identification of Expressed Protein
台灣大學農化系&&&&&& &
表現目標基因得到蛋白質後，可以進行各種純化方法
等)，以便分離出目標蛋白質；同時並檢定其各種基本生化性質
(如 、、、
本章是以表現蛋白質 GUS
為例，說明其純化及檢定方法；因為各種蛋白質的性質差異很大，因此每種蛋白質都有其特定的純化或檢定條件，必須個別去找出其自身的條件。本章整體實驗流程如
蛋白質純化方法
利用蛋白質間
，可以分離並純化出各種蛋白質。純化蛋白質的方法主要是以
進行，但是利用蛋白質分子物理或化學特性的沈澱方法，也是相當簡單、有效而且經濟。
蛋白質在細菌中表現後，以反覆的冷凍-解凍方法打破細胞，再用
把蛋白質沉澱下來，此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質等雜物。
儀器用具：
恆溫震盪培養箱
(使用 20,000 rpm 離心陀)
u使用高速離心機要注意：
離心機及離心陀的溫度要預冷完全，相對位置的兩隻離心管要平衡好，離心陀轉速絕對
不能超過最高速限。
液態氮及冰筒
藥品試劑：
pQG11/M15 [pREP] 單一菌落
LB/amp/kan
及 IPTG (1 M stock)
buffer (50 mM Na3PO4·12H2O, pH 7.0; 0.1
M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2% Triton X-100)
使用前添加成
10 mM b-mercaptoethanol, 25 mg/mL
PMSF, 40 mg/mL lysozyme。
A-0 (50 mM Na3PO4, pH 7.0)
使用前每 1 L 添加 70 mL b-mercaptoethanol
成為 <font color="# mM 最終濃度。
A-150: Buffer A-0 再加有 0.15 M NaCl
(要烘乾並以研砵磨碎)
挑取培養皿上單一菌落，培養在 15 mL 之 LB/amp/kan
液體培養基中，以 120 rpm 轉速震盪，在 37℃
下培養過夜。
取上述菌液 6 mL 加入 300 mL 新鮮 LB/amp/kan
培養基中，以 120 rpm 37℃ 培養至 A600 = 0.6
後，加入 IPTG 成為 <font color="# mM
濃度，繼續以 120 rpm 在 37℃ 震盪培養 4 h。
將菌液倒入 50 mL 離心管 (conical tube) 中離心 10 min (5,000
倒去上清，可將菌塊連同離心管置 -20℃ 冰箱貯存。
取出含菌塊之離心管置碎冰上，待菌塊溶解後，以殘存液體均勻懸濁之。再加入
10 mL lysis buffer 輕輕懸浮之。
將菌液放在液態氮中冷凍 <font color="# min，然後在
水浴中搖盪溶解之。如此反覆三次，儘量不要產生大量氣泡。將離心管的內容物倒入
50 mL 高速離心機的離心管內。
離心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 取上清共 _____ mL，稱為 粗抽取液
(XT)；預留 100 mL
以便日後一起進行分析。
u此後樣本均得放置碎冰上，以低溫進行實驗。&
此上清加入 5 mL buffer A-0
混勻後倒入燒杯，置碎冰上放冷，不時攪拌並緩緩加入固體硫酸銨
_____ gm，使成為 <font color="#%
飽和度，加完後再攪拌 10 min。
找出該體積所要加的固體硫酸銨，以達 <font color="#%
離心 20 min (12,000 rpm, 4℃)
後小心倒去上清，取白色沈澱部份。
沈澱加以 2 mL buffer A-150
均勻懸濁之，再以桌上型離心機去除不溶物質，(10,000
rpm, 5 min)，共得 ______ mL，稱為 全蛋白質
(TP)；預留 100 mL，連同上述 XT
置 4℃ 冷藏。
其餘溶液部份準備進行膠體過濾層析，標示清楚後置 4℃
註解討論：
緩衝液中為何還要添加某些藥品或試劑？ (如硫酸銨, NaCl,
EDTA, PMSF, Triton X-100, b-mercaptoethanol 等)。
某些處理的意義何在？ (為何要冰浴、取沉澱或上清、冷藏或凍藏)
為何反覆冷凍-解凍可以把細菌打破？
還有哪些方法可以打破菌體？
以 lysis buffer
破菌時，如何得知你的細胞確實有破裂開來？
在細胞打破之後，想像你的目標樣本或蛋白質，會變成什麼樣子。
蛋白質沈澱時為何要緩緩加入硫酸銨？
若加太快會有何種後果？
若你的目標蛋白質不會被飽和硫酸銨沈澱下來，你將如何繼續實驗？
這給你何種訊息？
百分飽和濃度硫酸銨之添加量
最終硫酸銨百分飽和濃度
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Methods in Enzymology
(1990) Vol. 182, p. 291Data
for Biochemical Research (1969)
Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press.
不同大小的蛋白質分子進入
管柱，可依其
分子量 差異分離；是一種廣泛應用的
partition 色析法 ( , Gel Filtration)。
儀器用具：
)、鐵架、鐵夾及水平儀
此種管柱的底面積是 2 cm2，因此其總體積為 200
(, 需準備乾淨試管約 100 支)
u收集分劃有 滴數、體積、時間
三種選擇，因為我們不使用輸液幫浦，因此只能用滴數分劃，請先定好若干滴收一個體積分劃。
(低速 5,000 rpm)
u一般細胞實驗用的離心機即可，若用高速離心機則以低速轉動，但無法蓋上離心陀的蓋子，離心過程要特別小心。
濃縮用離心管
-30 (Amicon 4322) 請注意其使用方法
系列是利用離心力壓擠小分子，使之濾過超微薄膜上的小孔洞，是一種超微過濾法
(ultrafiltration)；Centriprep-30 可濾過 <font color="# kD
以下的分子，因此可以把水分子濾走，以達濃縮效果。
藥品試劑：
S-300 ()：
預先以緩衝液 buffer A-150
平衡好，並且使完全沈降後的膠體體積，佔全部體積的七至八成；要先預估好膠體的使用量。
膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產生氣泡。
系列膠體有相當大的吸附力，因此要在緩衝液加入 0.15 M
以上的 NaCl 以除去非專一性吸附。
u一般膠體過濾法均在冷房內操作，但為方便起見，本實驗均在室溫下操作；要儘量保持室溫的恆定，否則膠體溫度的變化會造成氣泡的生成。
A-150：注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致
( )： 溶於 1 mL 後每組取 0.4 mL
thyroglobulin (670 kD), bovine gamma globulin (158 kD), chicken ovalbumin
(44 kD), equine myoglobin (17 kD), vitamin B12 (1,350)
u除了上述標準分子量的各種蛋白質外，也可加入目標酵素一起進行膠體過濾，並以活性分析定出目標酵素的溶離體積。
管柱裝填：&
以純水沖洗玻璃管柱
(以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷)；並請了解管柱的構造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接分劃收集器，並以
buffer A-150
試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。
注意系統的擺設要適當，不要裝置於交通要衝。
依預估量取出 Sephacryl
膠體，注意膠體的溫度與緩衝液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震盪，使之完全懸浮，但勿產生太多氣泡。
在管柱內加入約 10 cm
高緩衝液，然後將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗後膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時，可於頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約
膠體完全沈降後，小心以 buffer A-150
加滿管柱，關閉出口，裝上頂端端蓋並連通緩衝液瓶，打開出口以重力流洗。
調整緩衝液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，並設定收集體積為
2.5 mL/tube。
膠柱流洗約 100 mL
後，關閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約
1 cm高，注意勿破壞膠體表面平整；
然後打開出口，使液面下降至膠體面，再關閉出口，準備注入樣本。
以微量吸管或滴管吸取樣本 (樣本體積不得超過膠體總體積的
<font color="#%)，沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面！
(樣本確實體積
_______ mL)
打開出口，同時開啟分劃收集器；當樣本完全沒入膠體時，關閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的
buffer A-150，打開出口待其慢慢進入膠體中，如此重複二次。不得擾動膠體表面，造成凹陷。
暫時關閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，並把頂端端蓋鎖上；然後打開出口開始溶離，調整緩衝液瓶的高度，使流速為
六秒一滴。
要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統運轉無礙，小心分劃收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜，收集約
收集分劃試管，進行蛋白質定量分析以及 GUS
活性測定，並請作圖。
u蛋白質定量及
GUS 活性分析方法，請見下面數節 (,
收集 GUS 活性區，以 Centriprep-30 濃縮至 10 mL 後，加 buffer
A-0 稀釋至 20 mL，再次濃縮至 _______ mL (GF)，保留
管柱請再以 buffer A-150 流洗 100 mL 後，小心放置一旁，準備以後進行分子量測定。
u在此期間，請注意不要讓管柱膠體乾掉，也要注意膠體溫度不可變化太大，否則膠體內將會產生氣泡，無法再用，必須重新裝填。
進行分子量測定前一天，請先以 buffer A-150 流洗 100 mL，並檢查膠柱內有無氣泡產生，若有嚴重的氣泡或乾裂，必須重新裝填管柱。
取標準分子量溶液 0.4 mL，加上純質目標酵素 0.5 mL (以親和層析法所得之
部份)，如上法注入管柱中，立刻開始進行膠體過濾，並收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。
收集所得的各分劃，進行蛋白質定量分析，可定出數個蛋白質尖峰，以作為分子量依據；另以目測法，決定
紅色高峰 的管數，則可定出
vitamin B12
的溶離管數。利用以上數據，可畫出分子量與溶離管數間的直線關係，作為分子量判定的標準校正線。
同樣的一批分劃，請進行
(GUS)，則可定出酵素的溶離體積，對照上述標準校正線，則可求出酵素的分子量。
&結果參考『』&
拆除管柱及保存膠體：
若管柱長期不用，應當自管柱中取出膠體，以緩衝液清洗後，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時可能不易取出，要有耐心地以緩衝液慢慢沖出來。
膠體可以加 0.01% NaN3
防止霉菌生長，但使用前記得要洗去；再度使用時，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結塊而不易打散者，也不要使用。
註解討論：
在裝填管柱之前，要先估計所要的膠體體積多少，如何預估之？
膠體層析操作，要能緊密裝填管柱膠體，為何要如此做？
在實際操作裝填管柱之前，請先以空的管柱模擬整個過程。
何謂色層分析法？ 為何膠體過濾法是一種 partition
色層分析法？
本實驗班所使用到的色層分析用具，雖已經相當齊全，但離正式研究需求，仍有少些距離。
以下列出一般常用的色析純化設備 (如
梯度製造器 可在離子交換法時，拉出各種溶離梯度。
輸液幫浦 可以穩定而有效地輸送緩衝液進入管柱。
管柱 可以加裝 reservoir
以便一次完成膠體的裝填；也可在膠體裝填完成之後，在膠面上方接一
adaptor 以便消除無效空間。
監視及記錄器
可同步監視管柱溶離出來的物質，且忠實記錄。
分劃收集器
可收集所有的溶離分劃，是最不可缺的用具。
.2& 色層分析的設備及裝置
各種蛋白質分子上可能帶有不同的電性，經過離子交換管柱，可依其分子
的差異而分離開來
( , Ion Exchange)。
儀器用具：
(, 另需準備乾淨試管約 60 支)
(低速 5,000 rpm) 及濃縮離心管 Centriprep-30
藥品試劑：
Sephacel (膠體體積約 15 mL，預先以緩衝液 Buffer A-0 平衡好)
A-0 (如上述配法)
A-300 溶離液：Buffer A-0 加有 0.3 M NaCl
A-500 溶離液：Buffer A-0 加有 0.5 M NaCl
將 Econo-Pac 管柱架好，並將三向閥及軟管等組合完成。
震盪 DEAE Sephacel
膠體使之懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢沈降，在沈降過程中隨時加入
buffer A-0，勿使膠體乾掉。
待膠體沈降完全後，高度應在 <font color="# cm
左右。膠柱以 buffer A-0 一直流洗，流速快慢可以不考慮；連接好收集器，每試管收
u離子交換法的膠體平衡極為重要，可測流出液的 pH
或離子濃度，看是否與 buffer A-0
相同，若不一樣則需要再流洗之。
樣本的添加方法同上述膠體過濾法，並啟動分劃收集器開始收集，當樣本全部沒入膠體後，再加入同體積
buffer A-0。以 buffer A-0 流洗 50 mL
後，去除膠體上方的緩衝液，但勿使膠體乾掉。
然後依序以 buffer A-300, buffer A-500 溶離之，每批次流洗各
50 mL，注意更換濃度時，膠體上方勿殘存上一種溶液。
收集所有分劃，進行蛋白質定量分析以及 GUS
活性測定，結果作圖。
收集 GUS 活性區，並以 Centriprep-30 濃縮至 _______ mL (IEX)，記得要保留
離子交換膠體以 buffer A-0 洗過 50 mL 後，收起來交回。
註解討論：
離子交換膠體一定要平衡在緩衝液中，如何確知膠體已平衡完全？。
為何要逐漸升高鹽濃度？ 其作用機理為何？
蛋白質分子大多帶有電荷，此種性質是如何形成的？
在實際操作裝填管柱之前，請先在心中或紙上模擬整個實驗過程。
若表現蛋白質上含有一段
的片段，而親和吸著劑膠體上接有鎳離子，此蛋白質會專一性地結合到吸著膠體；洗去雜質後可用
imidazole 溶離純質蛋白質 ( , Affinity
Chromatography)。
儀器用具：
親和層析管柱
(另需準備乾淨試管約 25 支)
藥品試劑：
金屬螯合親和層析膠體
u在洋菜膠粒上接有
nitrilotriacetic acid (NTA)
官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和之。
B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl)
u在使用前才添加成
10 mM b-mercaptoethanol。洋菜膠粒上接有
nitrilotriacetic acid (NTA)
官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和。
B-300/20: Buffer B-300/0 加有 20 mM imidazole
B-300/250: Buffer B-300/0 加有 250 mM imidazole
親和層析膠體 1 mL
已經裝填在管柱內，成為一淡藍色膠柱。請把管柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用
buffer B-300/0 流洗 20 mL 後塞住出口，準備注入樣本。
除去膠面上方的緩衝液，並取出樣本 ()
使其回到室溫，慢慢用滴管加到親和膠體上，小心勿弄亂膠體表面；讓樣本沒入膠體中，同時收集流出液每管
待樣本全部進入膠體後，關閉出口，再慢慢加入 buffer
B-300/20，打開出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗 30 mL。
接著以 buffer B-300/250 流洗 30 mL，方法同上，收集各分劃。
所有分劃均定量蛋白質並測定酵素活性，收集酵素活性最高的數個分劃，共得
_______ mL (AF)，保留 100 mL
以供分析。
註解討論：
離子交換法及親和層析法操作時，當你要換用另一種溶離液時，膠體表面上能不能留有原來的緩衝液？
目標蛋白質 GUS 是如何接到親和膠體上？
又是如何被溶離下來的？
若你發現蛋白質無法結合到 Ni-NTA
親和膠體上去，但你確定蛋白質上有 His
片段，則如何解釋之？
親和層析法的種類非常多，只要兩種物質間有專一性的親和力，就可設計以親和法來進行純化工作，請儘量舉出你所知道的各種例子。
最近修訂日期︰豆丁精品文档： 鸡蛋清 鸡蛋清敷脸 鸡蛋清面膜 鸡蛋清的作用 鸡蛋清去黑头 鸡蛋清..
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鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012
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硕士论文-巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶的研究
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3秒自动关闭窗口如何证实包涵体的存在
23:11:46&&&来源：&&&评论：&&
[如何证实包涵体的存在] 我在用pET-28-a载体在E.coli.表达真核蛋白，sds－page表明有目的蛋白条带出现，但用常规破壁裂解提不出目标蛋白，此蛋白有his６标签，用Ni亲和层析未能得到蛋白，我提出蛋白可能存在包涵体内，需要购买一些试剂（不到200.00 RMBlack Eye按照包涵体的提取方案进行，但上司要求 关键词:[包涵体 复性 蛋白质 尿素 透析 溶菌酶 二硫键 细菌]…
我在用pET-28-a载体在E.coli.表达真核蛋白，sds－page表明有目的蛋白条带出现，但用常规破壁裂解提不出目标蛋白，此蛋白有his６标签，用Ni亲和层析未能得到蛋白，我提出蛋白可能存在包涵体内，需要购买一些（不到200.00 RMBlack Eye按照包涵体的提取方案进行，但上司要求我先要证实包涵体的存在，我找遍了＜分子克隆＞均没有简单可行的办法．求救简单可行的验证办法．回复
裂解细胞后，离心，分别取沉淀和上清电泳，包涵体都在沉淀中
但是裂解后其他不溶成分也在沉淀中,不能说明沉淀就是包涵体.
相差显微镜下观察菌体，包涵体的折光率不同； 深入的可以做电镜观察，能看到胞内有深色的大颗粒。
但是裂解后其他不溶成分也在沉淀中,不能说明沉淀就是包涵体.
确实是这样的，但是并不是让你凭借有无沉淀出现来断定是否为包含体，而是分别取破胞离心后的上清和沉淀来做电泳，看目标蛋白条带到底是在上清还是在沉淀的泳道中出现来断定的
你是不是要证明你的目的蛋白已经表达出来了？
那你可以用没有转基因的细胞和转基因的细胞表达后，分别破碎后跑SDS-PAGE看看两种细胞蛋白的条带是否有差异？
然后用zjtian 的方法确定是否是可溶性蛋白.
一般包涵体是不溶性蛋白。
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关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药(Biopharmaceutical)(Biopharmaceutical)(Biopharmaceutical)(Biopharmaceutical)的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁(cell wall)(cell wall)(cell wall)(cell wall)较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. &取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? & 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的. 2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？ 在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。 首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。 我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。 然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。 真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。 同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。 溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？
加入溶菌酶以后，如果细胞壁(cell wall)(cell wall)(cell wall)(cell wall)已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。 而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。 我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。 我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。 如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？ 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)细胞？ 溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。 哪儿的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到～8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。 另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。 我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。 溶菌酶的厂商要求是否很重要？ 我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。 是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用30－40 ml重悬。但实际操作也不够理想。 SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。 3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁(cell wall)(cell wall)(cell wall)(cell wall)成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法： 1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。 2 化学裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评） 3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中） 4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。 5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体 酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。 我用过化学裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），据说效果可以 酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。 4、超声破碎的条件选择 超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。 5、如何鉴定细菌超声破碎的程度 最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察 切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下 6、细菌裂解的DNaseI 不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。 另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。 我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。 我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。 其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。 7、超声裂解细菌是否完全？ 最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察 切记：只用结晶紫染色 二、包涵体的洗涤 1、包涵体的洗涤问题 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！ 三、关于包涵体的溶解： 1、 请教GST包涵体溶解 直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的） 我所用的包涵体提取方法： 1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮 ２．４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清 ３．用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次 ４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml　２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时 ５．４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清 ６．加２０％ＰＥＧ４０００　２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,静置３０分钟至２小时（亦可４度复性过夜） ７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存备用 ！Buffer A配方： 　　　Tris-base 50mM EDTA 0.5mM NaCl 50mM 甘油　　5% DTT 5mM 2、包涵体的溶解 十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了 3、有关包涵体的溶解问题 强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存? 我在4度放了半个月，目前没出什么问题 5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题? BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。 6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？ GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的 GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？ 做完裂解之后加Triton　X－100轻摇３０min，蛋白溶解的会多些！ 四、包涵体的复性 1、包涵体如何复性 包涵体的复性主要有两种方式： 1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释 2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂 其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！ 另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次 你家了多少蛋白呀 ？蛋白量过大也会使复性困难。 你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！ 最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了~~ 包涵体的复性还要注意以下几点： 1.首先要获得较高纯度的包涵体。 2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。 3.透析前后均要离心 4.透析不能太快. 5.纯化的最佳条件要摸索。 小技巧： 1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100. 2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性 3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h 4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h 5) 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解） 6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。
我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。 这段文字可以参考： 用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。 渗透休克 用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10体积100% TCA (w/v)，涡漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。 超声波裂解细菌 渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100×OD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。 1.2.7重组融合蛋白的纯化 PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3），TB培养基中，25℃，AMP 200 ug/ml，摇床（250 r／min）培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g离心收集菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。 或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。 洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。 3、包涵体复性2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。 另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。 对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。 5、包涵体复性问题 包含体复性三大原则： 1。低浓度 2。平缓梯度 3。低温 有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。 此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。 6、包涵体复性形成聚集物 关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！ 7、复性中蛋白析出！ 出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。 若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M； 另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。 8、包涵体复性液配方 对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题： 1）最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2) 温度适宜选择4℃； 3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4) 复性时间一般为24-36小时； 5) 低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6) 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。 还有就是你的蛋白质的特性 9、什么叫复性成功 复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同， 4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5，黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息(bioinformation)(bioinformation)(bioinformation)(bioinformation)学、蛋白质工程(Protein Engineering)(Protein Engineering)(Protein Engineering)(Protein Engineering)学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。 另外，还向这位战友荐一文章，有关包涵体蛋白复性的文章！ 点击浏览该文件 10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功 问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。 如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？ 如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？ 答：1）。不可以。GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的，一小段TAG 空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA 对应的抗体结合。 2）。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 3）。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。 4） GST为26kd,你得到的蛋白活性应通过 目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物，但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化，去掉抗GST抗体，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去 ＧＳＴ，再免疫动物.GSH,Tris 是小 分子，没影响。 5） 既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构，这就要看你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较，看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。 变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。 6） 做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些 另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？那里可能有许多的有活性的蛋白呀 五、包涵体的纯化 复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。（注：当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。） 六、综述以及其他 1、蛋白复性和纯化在线资料 1. 包涵体表达的蛋白的复性 http://www.sinobio.net/method/ecoli.htm#1 2. 重组蛋白纯化方法 组织细胞的破碎 http://www.sinobio.net/method/sansheng/dissociation.htm 目标蛋白的粗提 http://www.sinobio.net/method/sansheng/extracting.htm 蛋白质沉淀方法 http://www.sinobio.net/method/sansheng/precipitation.htm 色谱分离 http://www.sinobio.net/method/sansheng/chromatogram.htm
2、综述 蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。 可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。 包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性 包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎 分离： 1、离心：g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解： 常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。 去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。 极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH&9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 还原剂： 由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。 还原剂的去除： 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。 常用的氧化方法有： 空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。 复性的效率： 复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。 复性过程的添加剂： 1、共溶剂：如PEG，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。 2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。 3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。 4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。 5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。 6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。 7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。 8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。 当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。 复性时的蛋白浓度： 一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。 复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。 4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。 6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 几个复性的实例： 1、MHCII JBC 269（47）：1994 增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr. 复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein. 2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5. 复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。 3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。 增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml. 复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。 纯化： 一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond&5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。 当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。 从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。
溶解包含体
应用18ml缓冲液A和2ml 20% DOC储液于包涵体沉淀(DOC净浓度为2％)。充分重悬沉淀，室温下静置至少10min。悬液于4℃、13000rpm离心10min。上清弃去前，取上清留样。为确保沉淀得到充分洗涤，再次按步骤1所述操作重悬沉淀。于4℃、13000rpm离心10min。对沉淀，加200m1含8M尿素的缓冲液A。应剧烈搅动使沉淀慢慢溶解。然后静置1小时。管中溶解的蛋白质悬液，于4℃、13 000r／min离心10min。收集上清，弃沉淀(沉淀不应太多)。将上清转移至透析袋。用具长茎的聚丙烯小漏斗灌人透析袋。排出过量的空气，留出50％空余(透析袋应是瘪的，无空气)。透析袋两头至少打双结扎紧或用夹钳夹紧。4℃下，对蒸馏水透析4h，其间换液一次。然后，转至4000ml 缓冲液A中。继续透析过夜(4℃)。对4000ml Binding Buffer透析12小时。透析后的蛋白质悬液，于4℃、13 000r／min离心10min。收集上清，弃沉淀(沉淀不应太多)。
取诱导菌和未诱导对照菌， 将裂解总蛋白离心
沉淀和上清分别电泳
对比诱导前后蛋白差异
若明确有蛋白表达且在沉淀组分
可证明有包涵体存在
包涵体溶解一般只要尿素或盐酸胍，这个常规还要上司同意请购？
裂解液加1% triton或者2M尿素，如果目的蛋白条带还在沉淀里那肯定就是包涵体了
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