新手刚做western,有几个地方飓风营救几个不明白的

western blot图中,IP IB Flag 左边那些VEGFR-3-Flag,p85α-HA IB:Flag IB:HA我稍微有点明白了,但还是有几点不明白:(1)“从最右边看,表示细胞再转染了这三种质粒后,能够在细胞中表达”怎么看出来表达了?为什么要做lysate的westernblot图呢?(2)你说的看最右边、中间、左边的图是指最右边、中间、左边上下两个图对着比较吗?(3)你说的“研究片段”指的是SH2?(4 ) 还有拉不拉不出来怎么看?互相之间能被拉就是说有相互作用?比如说最左边的图是不是应该看左下图左右之间的条带粗细对比,中间的图是看中上图左右之间的条带粗细对比(5)‘相互作用的位点不在其SH2上“ 这个结论不懂,既然是缺失SH2的P85不能被VEGFR拉出,但正常的P85能被VEGFR拉出,不正说明了作用位点在SH2上吗?还望大神不吝赐教!菜鸟跪谢啦
IB是免疫印记、IP是免疫共沉淀、Flag和HA都是一种蛋白标签从最右边看,表示细胞再转染了这三种质粒后,能够在细胞中表达,最左边的图是用带有Flag标签的VEGFR拉p85及其研究片段,从图中可以看出,p85被拉出,而其研究片段没有被拉出,中间的图是反过来用p85及其研究片段拉VEGFR,同样可以看出p85可以把VEGFR拉出,而其研究片段没有被拉出,结论是VEGFR与P85存在相互作用,但是相互作用的位点不在其SH2上
这些概念我百度到了,主要是我不明白这图应该怎么看啊?
后边我说的很详细了,希望能帮到你
大神,能再帮我解答一下吧,问题有点多没法追问,我添加到问题里啦!谢谢!
能不能拉出来都需要对比着条带的位置去看,如果那个地方有条带,代表能拉的出来。做lysate的westernblot图是为了证明质粒是可以正常表达的,也就是说质粒是没有问题的,这是前提。
由于毕业太久了,对一些表示方法有些淡忘,这里更正一下,非常抱歉,结论应该是VEGFR与P85存在相互作用,相互作用的位点在其SH2上。非常抱歉
真的很感谢你耐心的解答!谢谢!
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【求助】做western跑胶上样,什么叫定量,半定量?
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本人是新手,刚做western有许多问题要请教大家:
关于上样时定量和半定量有什么区别?定量后免疫印迹后曝光后的条带怎样定量强弱?谢谢大家!查看完整版本请点击这里:
standbyme ( 17:23:39)
楼上说的对,上样没有定量和半定量的说法。我们在上样之前进行先进行定量,其实这也只是一个相对的定量,不能代表样品立蛋白的真实含量。
INK ( 17:24:00)
请教上一楼一个问题:如果上样前定量并不能代表样品蛋白的真实含量,那这个定量是不是没有意义了呢?
一直没有搞懂这个问题,诚心请教。
kuaizige ( 17:24:26)
楼主的意思我不太明白, 但关键是要加一个内参对照(B-actin )!就像做PCR一样! 不知是否理解错了?
xiaoxiaoniao ( 17:24:48)
上样前定量是为保证各样品之间总蛋白量一致,从而检测目标蛋白在各样品中的变化。由于western本身会受到多种因素的影响,并不是很精确,所以看目标蛋白的量的变化,只能看个大体趋势,也就是所谓的半定量。同时,还可以检测一些内参蛋白(不受你的实验处理影响的蛋白)如tubulin或B-actin ,以显示你的各样品上样量一致,说明你的目标蛋白的量的变化不是由于上样量不一致引起的,而确实是由于对各样品的处理不同引起的。
DDD ( 17:25:10)
western是不需要内参的,因为那样统计起来没有好的统计方法,再说内参的出片是个问题!我的经验,这是国家重点实验室的经验呀!有什么不明白可以联系呀!
langlang ( 17:25:50)
我现在正在准备做WESTERN,有的人说要用内参,有的人说不用。到底是怎么回事呢?可以给我解释一下吗?谢谢!
ero11 ( 17:26:13)
1.可以事先计算蛋白浓度,20-30UG/次/WELL.2.但是仍要做ACTIN确保你上的样量相同.3.如果你只要定性即有或无,就没比要顶量.否则,至少要做3次一上(包括ACTIN). 才能顶量.ACTIN 是必需的.否则PAPER 不接受.
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