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Western blot 实验技术及常见问题分析
作者：admin
信息来源：达科为
日期：2014年12月11日
Western&blot基本原理：
在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western&blot应用：
目的蛋白的表达特性分析；
目的蛋白与其他蛋白的互作；
目的蛋白的组织定位；
目的蛋白的表达量分析；
Western&blot一般流程：
蛋白样品的制备：
1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解&&度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；
2&有机溶剂提取法；
3&离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强；
4&通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。
Western&blot注意事项和常见问题：
1&我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS&浓度，同时将样品煮沸时间延长；&也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
2&我做的蛋白质分子量很小（10&KD），请问怎么做WB？
答：可以选择0.2&μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。
3 最后显色时用&DAB好还是ECM好？
答：DAB&有毒，但是比较灵敏，是HRP&最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg&级蛋白，具体可以根据你实验的情况。
4&要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western&blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western &blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定&量，但是不能定位。
& &②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
5&细胞水平要做western&blot，多少细胞提的蛋白够做western&blot？
答：一般5×106就足够了。
6&同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western&blot有无影响？
答：能，没有问题。
7 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western&Blot检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
8&蛋白变性后可以存放多久？
答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
9&二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？
答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。
10&做组织样品的western的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。
11&免疫组化和Western&Blot可以用同一种抗体吗？
答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
12&在做Western&Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
13&检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？
答：可以。
14&蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA，&45-60min就可以了，&可以根据你实验室的经验调节；170kd&用&7%&SDS－PAGE，200mA&90-120min。
15&细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。
16&PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
17&westernblot内参选择什么合适？
答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin&B1、TBP和histone。
18 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？
答：转移缓冲液中加入20%&甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转移时间。
19 转膜时凝胶肿胀或卷曲？
答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。
20 跑胶的条带歪斜或者漂移？
答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。
21 转膜后膜上有单个或多个白点？
答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。
22 转膜缓冲液过热？
答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。
23 显影后胶片背景太高？
答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。
24 结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？
答：样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。
25 目的条带位置偏低或者偏高？
答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。
26 有非特异性条带？
答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。
27 胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。&&&&&二抗的HRP&活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。
28 目的条带是白色，周围有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。
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标题: 做了五六次Western Blot，内参都不出！
摘要: [做了五六次Western Blot，内参都不出！] 因为刚开始的时候是用的师姐留下的SDS，结成团了，实验室的老师说是过期的，后来就新买了SDS、甘氨酸、Tris碱重新配了液体也不出！配方是跟实验室的老师要的，人家也是这么配的，也跑的出来……我的操作是这样的：1、配胶，4℃冰箱过夜 2、次日，上样（湿加），跑电泳，80v40分钟左右，待蛋白跑 关键词:[内参 一抗 条带 荧光 转膜 上清 抗体 试剂盒]……
因为刚开始的时候是用的师姐留下的SDS，结成团了，实验室的老师说是过期的，后来就新买了SDS、甘氨酸、Tris碱重新配了液体也不出！配方是跟实验室的老师要的，人家也是这么配的，也跑的出来……
我的操作是这样的：
1、配胶，4℃冰箱过夜
2、次日，上样（湿加），跑电泳，80v40分钟左右，待蛋白跑过了浓缩胶降电压调到100v，刚好跑出胶时停止。
3、根据MARK割下内参所在区域（36kd），胶放到转膜液中。
4、PVDF膜剪好后在甲醇中涮15秒左右，转入转膜液中浸泡。
5、转膜，电流110mA，1小时。
6、5%封闭液封闭1小时。
7、TBST洗3分钟
8、孵内参，4℃，过夜。
9、次日，膜用TBST洗3分钟后显影（10分钟、30分钟不等，加了发光剂也未见荧光），什么也没有，白片一张
实验时间不多了！急啊！恳请各位多多指教啊！小女子不胜感激！回复
补充：我用的内参是康成的GAPDH，不用孵二抗。
那还是一抗的问题 我之前也跑不出来 换了个一抗就好了
兄弟，我以前来这里求助都很少有高人来帮忙解决问题，看你这么可怜我决定帮你分析下原因。
首先，你蛋白样本是哪来的？有没有加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)？怎么保存的？保存了多久？上样是多少ug？一般来说只要上样1ug蛋白就能看到很明显的GAPDH条带，假如蛋白有问题你是啥条带都看不到的。
其次，我认为westernblot实验步骤其实很简单，稍微注意一点都能做出条带来，只是好看不好看的区别。鉴于你内参条带看不到，如果靶蛋白也没有，最可能的是转膜有问题，比如膜和胶的层次放错了。你看看你的膜上有没有marker条带就大致明白了。
再次，康城的GAPDH抗体是很敏感很特异的，要4度保存，不能反复冻融，一般1：就足足够了，假如抗体放得太久了，或者保存不好，也是做不出条带的。另外我不知道你是怎么孵抗体的，我想应该没有问题吧。
最后，你是用什么曝光的？我们是用专门的化学发光仪曝光，一般5-10s就能得到很好的条带。有的同学不会使用化学发光仪，所以无论怎么曝光都是白板一点都不稀奇。还有一种情况是蛋白上样量过高，一抗浓度也过高，导致过曝，ECL一加上去就被完全反应光了，等你拿去采集信号的时候当然是白板，不过这时你会发现膜上条带位置发黄。
你自己总结一下吧，多请教身边的老师和同学，上网请教实在是下下策。
下面是我认为可能出的问题，仅作参考，按照你自己的情况看：
1.你的胶配出来之后可以直接用的，也可以保存一段时间，保存时间以不超过10天为宜，保存方法：用滤纸把胶包好，然后把滤纸打湿，装在密封袋中保持胶的湿润，保存过程中不可以把梳子拿下来。
2.你转膜时是‘转膜，电流110mA，1小时’，那么你转完膜后在膜上能看到Marker条带吗，如果膜上Marker条带没有或者是在胶上仍然能够看到marker条带的话，可能你的转膜时间不够或者之前存在问题；如果膜上Marker条带完整的话，那么可能是抗体的问题了，你看看是不是你的一抗过期了或者是保存方法不得当。康成的GAPDH还是很好用的
如果你确定转膜没有问题，显色可以不用发光的，直接用NBT和BCIP显色，既方便又快，我都是这么做的，效果很好
兄弟，我以前来这里求助都很少有高人来帮忙解决问题，看你这么可怜我决定帮你分析下原因。
首先，你蛋白样本是哪来的？有没有加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)？怎么保存的？保存了多久？上样是多少ug？一般来说只要上样1ug蛋白就能看到很明显的GAPDH ... 非常感谢你的意见！！！
首先我的蛋白是从培养的肝癌细胞培养出来的，提蛋白的东西是买试剂盒，pierce的，M-PER& Mammalian P rotein Extraction Reagent，25平方厘米的细胞培养瓶，细胞长到80~90%，PBS洗三次，每次5毫升，然后用胰酶把细胞消化下来，放到离心管中，8000转5分钟，弃上清，加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，再加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，加提蛋白的那瓶东西，200微升，混匀，震荡，5分钟后，将这些液体移到1.5EP管中，常温，12000转10分钟，取上清，分装，-20℃保存，留一点BCA法测蛋白量，测得3~4微克这样。
这些蛋白三天后拿来做WB，100微升蛋白+25微升上样缓冲液，煮沸5分钟，常温冷却，上样量是30微升。
转膜液是用别人的（别人做得出来的），自己配的不敢用了。转完膜后能在膜上看到mark。
转膜的时候，夹子的黑面我放在下面，接着是一层海绵，三层滤纸，胶，PVDF膜，三层滤纸，一层海绵。
康城的内参是用一个老师的，别人也是用他的，也跑得出来，但是，是配好后分装几管，每次用完后放-20摄氏度保存，要用的时候才拿出来融。
目的我还没做，一抗是买sigma的，拿来做免疫组化，效果也不是很好~
ECL试剂盒是碧云天的，1：1配制，每次加完后，都没见过荧光。
我现在很纳闷啊！步骤的话，我跟周围的老师和同学说了，他们都说跟他们做的都一样的~
最后还是很感谢你的答复！
如果你确定转膜没有问题，显色可以不用发光的，直接用NBT和BCIP显色，既方便又快，我都是这么做的，效果很好 谢谢回复！
请问NBT和BCIP是什么东东呢？
下面是我认为可能出的问题，仅作参考，按照你自己的情况看：
1.你的胶配出来之后可以直接用的，也可以保存一段时间，保存时间以不超过10天为宜，保存方法：用滤纸把胶包好，然后把滤纸打湿，装在密封袋中保持胶的湿润，保存过程中不可以 ... 谢谢你的回复！
1、胶的话，我是听前辈说，这样放4度过夜好一点，所以就跟着做了~如你所说，能马上用的话，那就更好了！
2、转完膜后膜上能看到完整的MARK，胶上没见有MARK的条带了。
3、至于抗体，我只跑了内参，目的没跑，所以，一抗、二抗都还没用上呢~但是内参是用完之后-20℃存放，用之前才拿出来解冻，而且我已经用了5次左右了还没换呢~我问过一个老师，他说这样不要紧……
那还是一抗的问题 我之前也跑不出来 换了个一抗就好了
谢谢你的回复！
我只跑了内参，目的还没跑呢……一抗还没用……
是两种染色剂，粉末状的，具体你可以上网查一下，将你二抗结合后的膜TBST洗三次后，将膜放入10mlAP底物缓冲液（Nacl 2.9256g，Mgcl2 0.5.64g用0.1M的Tris溶解至500ml），66ulNBT,33ul BCIP混合液中染色，十分钟差不多就能看到目的条带了，染色时间长点没事
非常感谢你的意见！！！
首先我的蛋白是从培养的肝癌细胞培养出来的，提蛋白的东西是买试剂盒，pierce的，M-PER& Mammalian P rotein Extraction Reagent，25平方厘米的细胞培养瓶，细胞长到80~90%，PBS洗三次，每次5毫升，然后用胰酶把细胞消化下来，放到离心管中，8000转5分钟，弃上清，加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，再加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，加提蛋白的那瓶东西，200微升，混匀，震荡，5分钟后，将这些液体移到1.5EP管中，常温，12000转10分钟，取上清，分装，-20℃保存，留一点BCA法测蛋白量，测得3~4微克这样。
这些蛋白三天后拿来做WB，100微升蛋白+25微升上样缓冲液，煮沸5分钟，常温冷却，上样量是30微升。
转膜液是用别人的（别人做得出来的），自己配的不敢用了。转完膜后能在膜上看到mark。
转膜的时候，夹子的黑面我放在下面，接着是一层海绵，三层滤纸，胶，PVDF膜，三层滤纸，一层海绵。
康城的内参是用一个老师的，别人也是用他的，也跑得出来，但是，是配好后分装几管，每次用完后放-20摄氏度保存，要用的时候才拿出来融。
目的我还没做，一抗是买sigma的，拿来做免疫组化，效果也不是很好~
ECL试剂盒是碧云天的，1：1配制，每次加完后，都没见过荧光。
我现在很纳闷啊！步骤的话，我跟周围的老师和同学说了，他们都说跟他们做的都一样的~
最后还是很感谢你的答复！
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你细胞蛋白都上了72ug？我做全细胞蛋白一般上10ug就足够了。如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了。另外你怎么看“荧光”的？在暗室压片么？化学发光和荧光是不一样的哦，你用错了仪器也是白板哦。
是两种染色剂，粉末状的，具体你可以上网查一下，将你二抗结合后的膜TBST洗三次后，将膜放入10mlAP底物缓冲液（Nacl 2.9256g，Mgcl2 0.5.64g用0.1M的Tris溶解至500ml），66ulNBT,33ul BCIP混合液中染色，十分钟差不多就能看到目的条带了，染色时间长点没事
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谢谢你的回复！
这样染出来的膜，直接用相机照相就行了？不用成像仪拍？
你细胞蛋白都上了72ug？我做全细胞蛋白一般上10ug就足够了。如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了。另外你怎么看“荧光”的？在暗室压片么？化学发光和荧光是不一样的哦，你用错了仪器也是白板哦。
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谢谢你的回复！
因为之前老师说我的蛋白提得太少了~说我算的不对！让我加30微升，最大量~那照你说的话，上样量10~20微升就够了是吗？
如果“如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了”出现这样的情况的时候，加了发光剂后，关掉红外灯的情况下能看到荧光吗？
所谓“荧光”是在暗室压片的时候，加了发光剂，关掉红外灯之后，在膜上看到的光。我也不知道叫“荧光”对不对，就是听见大家都这么说，我也就……呵呵~
就是用相机拍就好了，很方便
谢谢你的回复！
因为之前老师说我的蛋白提得太少了~说我算的不对！让我加30微升，最大量~那照你说的话，上样量10~20微升就够了是吗？
如果“如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了”出现这样的情况的时候，加了发光剂后，关掉红外灯的情况下能看到荧光吗？
所谓“荧光”是在暗室压片的时候，加了发光剂，关掉红外灯之后，在膜上看到的光。我也不知道叫“荧光”对不对，就是听见大家都这么说，我也就……呵呵~
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ECL有没有问题啊？我无解了，压片是最敏感的方法了，其他方法你也可以尝试，祝好运~
谢谢你的回复！
因为之前老师说我的蛋白提得太少了~说我算的不对！让我加30微升，最大量~那照你说的话，上样量10~20微升就够了是吗？
如果“如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了”出现这样的情况的时候，加 ... ECL今天才到！但是之前有人用那个也做得出……
今天有个人做出来了，用的是我配的液体，几乎所有东西都是用我的，蛋白也拿我的去跑了~诡异的是，他跑目的都出来了，唯独内参不出来……我在想，是不是内参有问题呢？因为我都是只做内参，没做目的……明天我内参和目的都做做看看~
再次谢谢你的热心解答！
想问一下楼主，你的目的和内参都出了没有，我现在遇上了和你一样的情况了，做了好多回了，就是不出，一抗不管是目的还是内参的都没神魔问题，步骤也没发现明显错误，同学用我的内参一抗都出带了，但我的还是不出，急死了！
想问一下楼主，你的目的和内参都出了没有，我现在遇上了和你一样的情况了，做了好多回了，就是不出，一抗不管是目的还是内参的都没神魔问题，步骤也没发现明显错误，同学用我的内参一抗都出带了，但我的还是不出，急死了！ ... 你的内参和母的蛋白现在出来没？最后怎么解决的？我也是做不出来，或者出来时很细很浅的条带，上样量应该足够了。
想问一下楼主，你的目的和内参都出了没有，我现在遇上了和你一样的情况了，做了好多回了，就是不出，一抗不管是目的还是内参的都没神魔问题，步骤也没发现明显错误，同学用我的内参一抗都出带了，但我的还是不出，急死了！ ... 不好意思，最近比较忙，刚看到你的消息。我的目的内参都出了。最后发现应该是上样量太大，而发光剂放得太少导致的吧~那你的具体步骤是什么呢？WB一般是小细节上的错误导致结果不出的~
你的内参和母的蛋白现在出来没？最后怎么解决的？我也是做不出来，或者出来时很细很浅的条带，上样量应该足够了。 出来的是目的还是内参呢？
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电话：021-月度关注热点
【求助】western blot的最大上样量
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目标蛋白表达量少,想上样达到最大,请问最多能上样多少ug,而且蛋白条带不会弥散,
有人说只能90ug,但是,我上样到90,依然条带很浅细,几乎照不出来.请大家指教查看完整版本请点击这里：
kuohao17 ( 16:59:27)
个人感觉没关系吧，你先多上点，即便一开始弥散也没关系啊，能做出来再说做的漂亮，你觉得呢？
c86v ( 16:59:46)
使用1.5mm厚的胶，最大上样体积可以达到50ul。通过浓缩蛋白溶液，我上到150ug，条带依然很清楚。建议先用胰酶将细胞消化下来，同时采用并组，多收集一些细胞，再加少量细胞裂解液，即可达到浓缩蛋白的目的，上样量亦可提高
greenbee ( 17:00:04)
According to some referances, proteins transfered to the membrane from the SDS-PAGE gel may be refolded at least partially. This may be part of the reason for the recognition of the Ab and Ag.
yonger ( 17:00:20)
上样量的最大量不是以质量来算的，是体积问题吧！关键是你的蛋白浓度，要想条带好看可能0.75比1.5的好,上样量的多少就要靠你的蛋白浓度了，一般1.5的胶最多上50—60ul的样，而且很容易就溢出来了反而影响结果，建议使用蛋白浓缩试剂盒浓缩样本。还有就是建议6X的sample buffer比2x的好。如果内参都出不来，真的是提取的蛋白有问题了，是不是蛋白提取液太多，组织/细胞太少！
huifeng0516 ( 17:00:51)
楼上的大侠，我的内参也发不出来，但是目的蛋白很清楚，是不是提蛋白有问题呢
BUK ( 17:01:14)
上样量最大的问题，我个人理解是其实没有关系的，只要胶做的没有问题，你完全可以做一个浓度梯度的条件摸索的，比如100，150，170，200ug的上样量，哪个条带跑的有弥散了，就知道哪个是最大上样量了。我有时候上样量达到100条带弥散了，有时候又很好，所以个人觉得还是跟做的胶有一定的关系，还有就是空的泳道要加loading buffer填充才不会弥散。
911 ( 17:01:49)
“我的内参也发不出来，但是目的蛋白很清楚，是不是提蛋白有问题呢 ”
我觉得可能是你内参的抗体问题，看看实验室其他人用相同的抗体有没有问题，要不就换个内参看看，不要耽误时间！
redbutterfly ( 17:02:07)
我用60微升的,效果不错。不过我建议你多收集样本，少加裂解液。
101010 ( 17:03:38)
WB还算一个很灵敏的实验，如果上样量过大，相对而言结果的说服力就降低了。建议首先从样本中目标蛋白的收集这一步做起。如果是外源蛋白，增加表达的效率，如果是内源蛋白，注意一下收集时间（有些蛋白很快就在体内被降解了）。然后裂解时的体系不要太大，保证蛋白浓度。上样前定一下量，如果稀到了必须狂上样，还是趁早重做。
另外，梳子可以自制。我们师兄自己作的梳子能上120微升。
当初我开始WB的时候，上样很多，被师兄训阿……
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