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sf-900II SFM中文说明书
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CelliGen& 310 生物反应器培养 Sf9 细胞的应用
来源：艾本德中国有限公司　
Richard Mirro
New Brunswick, Enfield, CT& USA
Sf9昆虫细胞―杆状病毒系统被广泛用于各种重组蛋白的表达。该细胞为非贴壁依赖性细胞，适合高密度、大规模悬浮培养。利用生物反应器培养Sf9细胞可以很好的控制细胞的生长环境，大幅提高细胞的密度和蛋白的表达量。目前Sf9细胞在反应器内的悬浮培养方式主要以流加方式（Fed-batch）为主，其方法为随着细胞密度的增加和营养的消耗分次补加营养成分，但无培养液流出反应器。另外还有一种连续培养（Continuous）方式，其方法是根据连续地加入新鲜培养基，同时以相同的速度流出罐内培养液。本文主要对连续培养方式培养Sf9细胞进行介绍。
方法和设备
生物反应器：New Brunswick CelliGen 310，带旋转过滤器螺旋搅拌桨（Spin Filter Impeller） ，工作体积: 3.5 L
培养基：Sf-900 无血清培养基，GIBCO细胞接种密度：4.0-5.0×105个/ml
灌流速度：0-0.5工作体积（根据细胞密度提高）
&图1: 8日细胞密度与活细胞率示意图
&图2: 带旋转过滤器的搅拌桨
Sf9 在生物反应器内生长 8 天后达到最大密度 2.5×107个 /ml，同时活细胞率还能保持在 90% 以上（图 1）。相对于批次培养达到的最大密度6-12×106个/ml提高了2-4倍，为Sf9细胞在生物反应器内的高密度、大规模连续培养提供了基础。
带旋转过滤器螺旋搅拌桨（图 2）带有的细胞截留网（10 &m）可以将 Sf9 细胞截留在反应器内继续生长，不含细胞的上清液被灌流出反应器，同时补充新鲜培养基。这样的方式一方面提供了高密度细胞需要的营养成分；另一方面将细胞代谢产生的有害产物进行稀释，减少了对细胞的负面影响，最终实现了Sf9细胞的高密度培养。
信息来源：艾本德中国有限公司
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【专题讨论】杆状病毒――昆虫细胞蛋白表达系统，影响蛋白表达的因素？
不知道有多少人成功用杆状病毒――昆虫细胞表达系统成功进行过蛋白表达？我最近表达一段病毒的非结构蛋白nsp-6，构建的重组Bacmid质粒经PCR鉴定正确，可是进行表达时，却未见蛋白表达，同时进行的试剂盒对照（含CAT基因的重组细胞中则有较好的表达。我听说约有70%的蛋白在原核表达系统中是不表达的，但不知道这样的情况会不会发生在我用的昆虫细胞表达系统，除了实验操作失误方面的原因，还有什么因素是不使蛋白表达的，请大家讨论一下。下面是我的实验过程，请高手指教，同时希望也给新手一个指导吧（我使用的是Invitrogen的产品，具体说明书大家可以参照Invitogen操作手册>）：The genes of nsp-6 was cloned into BamHI and EcoRI sites of the pFastBac HTA vector, then the ligation reaction was transformed into DH10B and selected for ampicillin-resistant transformants (LB plates, ampicillin 100μg/ml); The constructed pFastBac vector was transformed into DH10Bac E.coli for transposition into the bacmid,&&blue/white selection was used to identify colonies containing the recombinant bacmid and the bacmid was also analyzed by PCR with the M13 primers. Once the recombinant bacmid was confirmed, it was ready to transfect insect cells.Sf9 were maintained in TNH-SFM complete medium。抱歉该段未翻译成中文。实验材料：1.&&重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。2.&&昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自 Roche。实验步骤：一、&&昆虫细胞转染：1．&&Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。2．&&准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a.&&溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。b.&&转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。c.&&将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。3．&&重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。4．&&取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。5．&&移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。二、&&病毒贮液的制备：1.&&病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。2.&&上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。3.&&病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。4.&&扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a.&&转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。b.&&每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。c.&&根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。d.&&制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。三、&&病毒贮液初步鉴定1.&&SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。2.&& western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。3.&&以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA试剂和说明书。结果1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细胞中。2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照his-CAT蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白his-nsp-6。在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：1. 利用细胞DNA提取试剂盒提取感染细胞的DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！你的实验过程我没有发现问题，具体原因真的难说。在BEVS系统中，Bac-to-Bac不是最有效的,我觉得没必要选择穿梭，效率低。你可以用pBacPAK或者诸如此类的载体，直接用线性化野生病毒去转染。你的实验过程绝对没问题，重组Bacmid你也鉴定了，那说明转座没有问题。而后的共转染也没问题，因为你的sf细胞看到了明显的病变，多角体也出现了。最好，你把p1和p2的病毒上清液以100 000 g超速离心30min并取其沉淀，用TE缓冲液悬浮后经蛋白酶K 37 ℃消化2 h，再经酚、酚-氯仿、氯仿抽提后用乙醇沉淀浓缩，以其为模板进行PCR鉴定。这样就可以完全放心，排除这之前的问题。如果鉴定正确，你就只从SDS-PAGE排除问题就可以了。是不是低表达的缘故？我觉得你SDS-PAGE技术肯定没有问题，因为你对照已经出来了。你可以增加sample量看看。最好一个个排除，试验就是这样，别急。如果有什么其它问题，我们可以在这里讨论。祝顺利，早日得到结果。Fishy兄高见，你的点拨让我眼前豁然开朗，有了新的思路，多谢。建议斑竹加分。顺便问一下P1或P2液取多少进行DNA抽提，方便的话，能不能将抽提具体方法在这里贴出来，让我和其它站友多一个学习的机会。我不知道你病毒的滴度，至于体积我想不成问题。你可以多制备点，反正是病毒繁殖，3天肯定发病，一般10毫升就行了。8000rpm离心10min，上清液用sw-27转子（Bechman）24000rpm超离30min，将沉淀的病毒粒子悬于1ml TE中，加蛋白酶K至终浓度50微克/微升，50度水浴2小时，再加Sarkosel至终浓度1%(根据本人经验，没有就可以不加），50度水浴2小时；用等体积饱和酚，氯仿/异戊醇各抽提一次，12000rpm离心5min,上清液加入2.5倍95%冷乙醇，DNA沉淀后，3000rpm离心10min,70%乙醇洗，溶于0.1乘TE中，电泳检查，4度放置。如果还有要讨论的，可以pm我，或者邮件交流。我正在用Invitrogen公司Bac-to-Bac& Baculovirus Expression System表达目的蛋白,构建好穿梭质粒pBACmid后,在转染入昆虫细胞sf21时碰到极大困难,经多次试验仍然无法成功转染.所用转染试剂CELLFECTIN、细胞sf21、需血清培养基Grace’s Insect Cell Culture Medium（PAA公司"GOLD" defined Foetal Bovine ）、无血清培养基Sf-900 II SFM都为Invitrogen公司新购产品（FBS除外，为PAA公司）。转染完全按照公司所推荐方案进行：1. In a 6-well or 35 mm tissue culture plate, seed 9 00000 Sf9 cells per well in 2 ml of growth medium containing antibiotics (e.g. 2 ml of Sf-900 II SFM containing 50 units/ml penicillin and 50 &g/ml streptomycin final concentration). 2. Allow cells to attach at 27°C for at least 1 hour. 3. For each transfection sample, prepare bacmid DNA:Cellfectin& Reagent complexes as follows in 12 x 75 mm sterile tubes. a. Dilute 1 &g of purified bacmid DNA in 100 &l of unsupplemented Grace’s Medium. b. Mix Cellfectin& Reagent thoroughly before use by inverting the tube 5-10 times. Remove 6 &l of Cellfectin& Reagent and dilute in 100 &l of unsupplemented Grace’s Medium. c. Combine the diluted bacmid DNA with the diluted Cellfectin& Reagent (total volume is ~210 &l). Mix gently and incubate for 15 to 45 minutes at room temperature. 4. While DNA:lipid complexes are incubating, remove the media from the cells and wash once with 2 ml of unsupplemented Grace’s Medium. Remove the wash media. 5. Add 0.8 ml of unsupplemented Grace’s Medium to each tube containing the DNA:lipid complexes. Mix gently and add the DNA:lipid complexes to each well containing cells. 6. Incubate the cells in a 27°C incubator for 5 hours. 7. Remove the DNA:lipid complexes and add 2 ml of complete growth media (e.g. Sf-900 II SFM containing antibiotics) to the cells. 8. Incubate the cells in a 27°C humidified incubator for 72 hours or until you start to see signs of viral infection.穿梭质粒pBACmid的提取起先是用Invitrogen公司推荐的手工方法，后来是用Promega公司Wizard& PlusMinipreps DNA Purification System；昆虫细胞的培养是用含10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，转染时换为无血清培养基Sf-900 II SFM（不含抗生素或其它添加剂）。所有试验都无法成功转染，故特来请教，望不吝赐教。To 免贵姓何站友： 您的操作过程若是完全按照上述protocol进行，应该是不会有问题的。穿梭质粒的提取我们目前也是用Invitrogen公司推荐的手工方法，结果很好，没出现什么问题。问题应该发生在以下这一步：昆虫细胞的培养是用含10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，转染时换为无血清培养基Sf-900 II SFM（不含抗生素或其它添加剂）。参考：1. 10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium是否含有L-谷氨酰胺，状态如何（要求细胞存活率应达到97%，才能达到较好的转染效果），首先排除转染前的细胞问题。2. 另外就是转染后你更换了培养基（从Grace’s Insect Cell Culture Medium到Sf-900 II SFM），我觉得问题最有可能出现在这一步，昆虫细胞一直是在10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium中培养，可转染后突然换成无血清培养基Sf-900 II SFM，对细胞生长是不利的。不知道你加入Sf-900 II SFM培养后的细胞状态如何。此处建议转染后仍然使用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，正式表达蛋白之前按照Invitrogen公司推荐的方法，让细胞先适应无血清的环境，方可进行大量感染及表达。祝好运！多谢coffejumps的及时回复,1. 关于L-谷氨酰胺,所购Grace’s Insect Cell Culture Medium(powder)中是含有的,贮藏过程中及配成溶液后在-20度和接下来的4度存放到底有无分解就不清楚了,但昆虫细胞的生长状态良好,这方面的问题应该不大.2.有一点我描述有误，虽然转染时我改用无FBS、无抗生素的Sf-900 II SFM，但转染后我又换回10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，之后细胞没有出现病毒感染迹象，细胞不停在生长。接下来我想对试验方案做以下改变:1.用promega公司Wizard& PlusMiniprepsDNA Purification System多提取pBACmid用以转染,因为所需DNA量是专指pBACmid,DH10BAC中的质粒除pBACmid外还有helper plasmid,pBACmid只占一部分。2.转染前一天接种细胞，但涉及到用何种培养基的问题，即接种后至转染这段时间是用不完全培养基还是完全培养基（转染前再用不完全培养基洗）。3、转染时不用Sf-900 II SFM 而改用不完全Grace’s Insect Cell Culture Medium（不含FBS和抗生素，但含lactoalbumin 和yeastolate）。不知以上考虑是否符合实际？另外,我用Invitrogen公司推荐的手工方法提取的穿梭质粒常混有RNA，我认为是操作方案中RNAaseA的作用温度为室温引起的,因为其它提取方法是在55度反应10分钟.而且该方案提取的质粒成分复杂，给穿梭质粒的定量也带来问题，你所说的穿梭质粒的量是如何精确度量的？我感觉,Fishy 兄的说法是有道理的。Bac-to-Bac系统不是最有效的,往往表达的效率不高，我所在的实验室的师兄表达蛋白占4―5％左右；而我用的是用线性化野生病毒，载体是pMelBac，转染表达是近20％，目前我所在实验室都已经用此载体了。不妨试一下。
另外，在表达物基因和表达系统间似乎还有某种相关性的联系，我也想请教各位前辈。谢谢！昨晚回复的帖子，因为服务器的问题，丢了，只好再回答一次。免贵姓何 wrote:多谢coffejumps的及时回复,1. 关于L-谷氨酰胺,所购Grace’s Insect Cell Culture Medium(powder)中是含有的,贮藏过程中及配成溶液后在-20度和接下来的4度存放到底有无分解就不清楚了,但昆虫细胞的生长状态良好,这方面的问题应该不大.一般L-谷氨酰胺在培养基中，4度可以稳定存在一个月左右，超过时间最好补加。另外不推荐将该培养基冻存于-20度，最好现配现用。但是既然你的细胞状态不错，那么应该不是培养基的原因。2.有一点我描述有误，虽然转染时我改用无FBS、无抗生素的Sf-900 II SFM，但转染后我又换回10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，之后细胞没有出现病毒感染迹象，细胞不停在生长。和正常细胞比较，72h后，没有任何变化？接下来我想对试验方案做以下改变:1.用promega公司Wizard& PlusMiniprepsDNA Purification System多提取pBACmid用以转染,因为所需DNA量是专指pBACmid,DH10BAC中的质粒除pBACmid外还有helper plasmid,pBACmid只占一部分。我也觉得用试剂盒提取会更好，只不过目前我们没有购买专门的提取试剂盒。但是我觉得这里的helper plasmid不会有太大影响，否则invitrogen 的protocol上也不会说可以用手工法提取了。而且我们就是用手工提取法做的，效果不错，就是不知道会不会对下一步蛋白表达的量有影响（这个问题还需进一步探讨）。2.转染前一天接种细胞，但涉及到用何种培养基的问题，即接种后至转染这段时间是用不完全培养基还是完全培养基（转染前再用不完全培养基洗）。我不建议提前一天接种细胞，因为细胞会进行增殖，这样转染的量可能会不准。至于培养基，我还是觉得用完全培养基好，这样可以保证转染前的细胞状态是最佳的。而且我们这样做，效果也是很明显的。3、转染时不用Sf-900 II SFM 而改用不完全Grace’s Insect Cell Culture Medium（不含FBS和抗生素，但含lactoalbumin 和yeastolate）。不知以上考虑是否符合实际？我们转染一直使用的是Grace’s Insect Cell Culture Medium, unsupplemented(Cat No.)，效果不错，而且我建议你不要使用抗生素，只要操作注意，不会造成污染，这样也不会让抗生素对转染造成可能的影响。另外,我用Invitrogen公司推荐的手工方法提取的穿梭质粒常混有RNA，我认为是操作方案中RNAaseA的作用温度为室温引起的,因为其它提取方法是在55度反应10分钟.而且该方案提取的质粒成分复杂，给穿梭质粒的定量也带来问题，你所说的穿梭质粒的量是如何精确度量的？ 我们通常采用紫外分光光度计对其定量。个人经验是：由于Bacmid比较大（&100Kb），提取出来的质粒要用水或者TE溶解，所使用的液体量是溶解常规质粒（5kb左右）体积的2倍，这样定量结果才准确。我提取的质粒OD260/OD280=2.0左右，说明还是比较纯的。（一般10ml菌液提取的bacmid 用150-180ul液体来溶解。）另外，你没有使用pFastBacHTCAT作对照吗？若这个也不行，可能是你的转染试剂有问题。您好，我也用该系统表达蛋白。转染步骤是按invitrogen 的protocol做的，细胞72h病变非常明显。但表达时细胞是用SF900-II
SFM（含10%FBS，1%F-68，青链霉素各100单位/毫升）培养的，然后细胞收集超声后上清浓缩做WESTERN没有条带出现。是不是表达时培养基中的FBS的影响？请多指教。 wrote:您好，我也用该系统表达蛋白。转染步骤是按invitrogen 的protocol做的，细胞72h病变非常明显。但表达时细胞是用SF900-II
SFM（含10%FBS，1%F-68，青链霉素各100单位/毫升）培养的，然后细胞收集超声后上清浓缩做WESTERN没有条带出现。是不是表达时培养基中的FBS的影响？请多指教。细胞病变，自然转染是成功的。不知道有否进行测序，请排除读码框错误的可能性。细胞超声后的上清应该是没什么FBS，不会对目的蛋白的检测有影响吧。表达的培养基中加入FBS可以防止目的蛋白的降解。但是可能对蛋白表达量有影响。可以和我一样，用细胞涂片做个免疫荧光鉴定一下目的蛋白。表达条件我们仍在摸索中，请继续关注并参与讨论。谢谢.我的目的片段测序是正确的.您说"建议转染后仍然使用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，正式表达蛋白之前按照Invitrogen公司推荐的方法，让细胞先适应无血清的环境，方可进行大量感染及表达。"我在扩增P1、P2、P3病毒贮液时是用SF900-II SFM（含10%FBS，1%F-68，青链霉素各100单位/毫升）,表达时是不是就按Invitrogen公司推荐的方法?您是怎么做的啊?To 站友：前一段时间一直是按照protocol和上面我所说明的那样，用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，然后取P3贮液，按MOI=5进行感染。细胞裂解液或细胞培养上清中一直无法用his单抗检测到蛋白（我们在考虑会不会是his标记被包裹在蛋白内部，无法暴露其抗原位点？可是除了his单抗，我们没有针对目的蛋白的特异性抗体〈仅有些效价不是很高的抗血清〉，也无法进一步用western blot鉴定，最后还是通过免疫荧光鉴定出有表达），当然我们用的一直是有血清的培养基，所以我说有血清的条件下可能对表达会有影响。我们做了病毒空斑纯化实验，并以pFastBacHTc-CAT转化的Bacmid-CAT作为阳性对照，以正常细胞做阴性对照，但是由于没什么经验，感染十天后，无法断定很明显的空斑，也没办法进行下一步的空斑纯化。当然这里也可能是我们操作的问题，这个实验就暂且停住了。另外，我们正准备在high five细胞中表达，即用无血清培养基培养的high five细胞在旋转培养瓶中进行感染表达，但目前实验设备刚准备好，细胞也长得较好，表达实验还没有开始，有了结果我会继续在这发帖。斗胆发表一下看法：1.构建好穿梭质粒后，有没有测序证实序列的正确性呢？因为一直没有看到coffejumps 提到读框的正确性问题;2.抗体是针对WB还是细胞免疫荧光？还是WB更为特异;3.High five细胞的表达量是最高的。lisjman wrote:1.构建好穿梭质粒后，有没有测序证实序列的正确性呢？因为一直没有看到coffejumps 提到读框的正确性问题;这也是一个问题，其实我在同时做四段目的基因的表达，虽然都进行了测序，但仅有两个是可以测出并核实正确的。其它两个经过反复测序提供了质粒、菌液（而且试了两家公司），但公司的回复是有复杂结构，信号有干扰，无法正常测序。但是目前免疫荧光的结果是同时几个都为阳性（当然绝对是做了阴性对照的），我想这个结果是可靠的。毕竟测序正确并且荧光检测阳性的结果是有的，说明构建质粒不可能都存在问题。我也想弄清楚究竟测序中的复杂结构，是不是会影响蛋白表达，实验进行中……2.抗体是针对WB还是细胞免疫荧光？还是WB更为特异;我说过我们只有抗血清，效价不高，故免疫印迹无法正常检测，由于是使用DAB显色而非曝光，所以检测灵敏度是低于免疫荧光的。由于同时进行了正常细胞和无关细胞、抗血清和无关抗体的多种对照，我想免疫荧光的特异性还是可以肯定的。3.High five细胞的表达量是最高的。同意，至少protocol是这么说的，故这也是下步的实验重点。刚才看到这些贴子，我也是做这个的。表达了几个蛋白，觉得这个系统的表达很subtle。有些蛋白就那么好表达，有些就怎么也弄不出来。因而经常去生化所吴老师组去讨教，了解了一些，与大家分享、讨论。不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。很佩服你，用BamH I和EcoR I来做Hta。这两个酶靠得很近，我有好几次想用他俩（酶的效率比较高），都没敢用，怕切不彻底。His Tag不应该会被包在内部，因为一般做的蛋白质电泳应该是变性胶吧。另外，我觉得转染前后不应该更换培基种类，那样会影响细胞状态的。我在做转染的时候只将FBS去除，protocol上说血清中的成分会对脂质体包埋DNA有影响，其他添加剂的影响应该不大吧。Grace’s培养基属于基础培养基，对这两株细胞（SF9 & High Five）都不是最适培基。sf细胞株以前使用Gibco的TC100，后来停产了，选用他们的SFM 900II，虽然说是无血清培基，我们还是加了10%的FBS。High Five 应该也有与它相适应的培基，好象是Express Five SFM。SF细胞适于悬浮培养，High Five好像偏向贴壁表达。我在做转染前，细胞通常贴壁过夜（让它适应一下），至少也要贴壁两个小时以上。转染后用封口膜将dish封闭放置四到五天（比说明书上的时间长）。扩毒的时间也比说明书上的时间长（视细胞状态，通常也是四到五天）。这样细胞向培基中释放出的病毒能多一些。我们这边有人做表达的时候，竟然染毒后一星期收细胞，见到她的蛋白表达那么大一坨！汗~~免贵姓何：我们也采用手抽Bacmid，试剂盒贵了些吧。在solution I中加入RNAse A，结果没见到很多的RNA呀。Help质粒是有的，不大影响转染。再发表一些我自己的愚见：转染效率不高对收获病毒影响很大么？只要有Bacmid DNA进入细胞，她不就能释放出来有感染活性的病毒么？不就可以感染周围的细胞么？比较蠢的想法。年底了，终于有蛋白被搞定了。把一月份的部分结果贴上来，大家看看。图中已经成功纯化的蛋白是病毒结构蛋白，非糖蛋白。这次表达量比较高，sf9和highfive细胞中均有较高的表达量，不过这次的纯化工作都是用highfive细胞完成的，感觉纯化比较简单。另外有个糖蛋白也成功进行了表达，但是表达量不高（不过好歹SDS-PAGE可以看到了），纯化过程也遇到了麻烦，发现同样的条件，根本不合Ni-NTA珠结合，条件还在摸，估计该糖蛋白经过糖基化修饰，折叠，his-tag被阻挡。郁闷ing!小结一下：目前的实验结果说明上述的实验方法没有问题，大家可以放心参考！证明免疫荧光阳性的结果是可信的，只是细胞表达量很低。前段时间开了个会，同一位老师交流了一下，他说他的一个蛋白也是表达量很低，每次纯化要培养大概100多毫升细胞，才能纯化出一点蛋白。所以该表达系统也不是万能的，虽然该系统是真核表达，但针对不同的蛋白，其表达量可有10-1000倍的差异，大家选用之前一定要想好。病毒空斑试验不做可以，但是由于不能确定病毒液的滴度，会影响表达量，但决不会影响表达
（缩略图，点击图片链接看原图）谢谢universea站友的参与，也感谢你的建议。universea wrote:不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。很佩服你，用BamH I和EcoR I来做Hta。这两个酶靠得很近，我有好几次想用他俩（酶的效率比较高），都没敢用，怕切不彻底。我目前纯化出来的这个蛋白，表达量大约在2-3mg/1*10^8个细胞，还不是很满意。呵呵，这两个酶的效率比较高，放心用！反正后面要鉴定嘛我在做转染前，细胞通常贴壁过夜（让它适应一下），至少也要贴壁两个小时以上。转染后用封口膜将dish封闭放置四到五天（比说明书上的时间长）。扩毒的时间也比说明书上的时间长（视细胞状态，通常也是四到五天）。这样细胞向培基中释放出的病毒能多一些。我们这边有人做表达的时候，竟然染毒后一星期收细胞，见到她的蛋白表达那么大一坨！汗~~这个状态怎么控制？谈谈你的经验如何？放一个星期都可以？？？晕！细胞破裂死亡不会导致表达蛋白降解吗？你们通常都表达什么性质的蛋白，稳定性如何，表达膜蛋白成功的例子多么？个人认为没有必要太拘泥于转染效率的问题. 其实如果严格按照protocol来做的话,一般都会得到可以的转染. 偶用普通的miniprep kit来提取Bacmid,浓度通常比较低,但是量是足够做转染了,所以偶也不太care啦. 转染效率低的话,后果就是P1的滴度低.但是这没关系,因为偶从未指望用P1来做什么实验. 在P1的基础上继续扩增P2,P3, 偶一般是感染4,5天后收集上清. P3的滴度都能达到10^8.在使用这个系统中,偶感到最为头疼的是培养sf-9细胞. 细胞状态老是不好. 传代的时候用一般的移液管根本就把细胞吹不下来. 换巴斯德细玻管也得费老半天劲才能下来,下来的细胞估计是受到创伤,状态总是不太好. 不知众位站友是怎么做的?yorktang wrote:个人认为没有必要太拘泥于转染效率的问题. 其实如果严格按照protocol来做的话,一般都会得到可以的转染. 偶用普通的miniprep kit来提取Bacmid,浓度通常比较低,但是量是足够做转染了,所以偶也不太care啦. 转染效率低的话,后果就是P1的滴度低.但是这没关系,因为偶从未指望用P1来做什么实验. 在P1的基础上继续扩增P2,P3, 偶一般是感染4,5天后收集上清. P3的滴度都能达到10^8.呵呵，深感赞同！在使用这个系统中,偶感到最为头疼的是培养sf-9细胞. 细胞状态老是不好. 传代的时候用一般的移液管根本就把细胞吹不下来. 换巴斯德细玻管也得费老半天劲才能下来,下来的细胞估计是受到创伤,状态总是不太好. 不知众位站友是怎么做的?细胞状态不好？还贴壁这么牢？我们使用10%胎牛血清的Grance全培，细胞状态很好，但是也是贴壁很牢，我们一直使用胰酶消化，效果 不错，好像对结果没有影响，对细胞状态也没有影响。细胞状态不好的时候,当然是飘起来的. 本来状态很好,费老劲搞下来传代以后,好多就飘起来啦. 每次就只好让它贴一小时,再扔掉不贴的. 浪费偶好多细胞.可以用胰酶消化吗? 偶试过一次,没下来,就再没试过.可以说说你用胰酶的浓度和时间吗? 谢谢楼上的兄弟.我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。You are welcome. Good luck!请教coffejumps我也在做sf9细胞表达蛋白，但是蛋白表达量没有你的高。目的蛋白分泌到上清中。纯化蛋白时，100ml细胞上清液仅能纯化约100ug蛋白。我的纯化方法是：细胞上清用PBS透析几次，然后过NTA-Ni柱。能否将你的蛋白纯化方法共享一下，谢过！yyljj wrote:请教coffejumps我也在做sf9细胞表达蛋白，但是蛋白表达量没有你的高。目的蛋白分泌到上清中。纯化蛋白时，100ml细胞上清液仅能纯化约100ug蛋白。我的纯化方法是：细胞上清用PBS透析几次，然后过NTA-Ni柱。能否将你的蛋白纯化方法共享一下，谢过！以前做过杆状病毒分泌表达的纯化工作，提供你一些意见，稍作参考。你的表达量还是很可以的，就分泌表达而言，完全能够纯化出来。我的实验技术路线如下：以1L的培养液上清为对象，先用阴离子交换层析柱富集，然后脱盐柱除掉部分色素，再直接上样于Ni-NTA上，条件成熟，大半天时间就可完成1L的纯化，我最终1L培养基中获得1.5mg的目的蛋白，纯度在90%以上。请教：你的Bacmid是如何提取的，怎么纯化的？转染剂量是否严格遵守操作手册的推荐剂量？你所说的“病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观”能否详细描述一下？不胜感激！！！菜鸟一只universea wrote:不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。深表赞同啊，我就是用bac-to-bac系统表达膜蛋白的，作了一年。一开始也是前面的步骤都没问题，就是最后的western做不出来，一直以为是序列有移码，测序存在问题。反反复复测了很多次结果都不一样，汗啊～～后来才发现是蛋白表达量太低，western没有检测到（因为当时的阳性对照是一直以为表达量应该差不多的蛋白，结果哪知道差那么多！）。最近提高一抗的稀释度4倍，就检测到了，提膜蛋白做纯度就更高了。这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？
感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～我是用Baculogold 来做蛋白表达的，做了一年多了，始终没有检测的到，细胞是sf9。
我的蛋白是膜蛋白，140kD，国外都表达出来了，但是我用我自己构建的病毒来做，怎么都没有做出来，听说膜蛋白很难表达，我想到底是什么问题？表达量文献上的很高，而我的western 都基本上看不出来。
我所怀疑的各个步骤都没有问题，包括病毒都是由感染性的，MOI试过n多次，我每次感染都是在72h或更长时间，后收细胞的，细胞病变很明显，对于这么大的蛋白，是不是时间短了阿，
不过在细胞的培养方面还是有很多经验的，希望和大家交流，也希望大家能在蛋白表达这方面给我指导，郁闷中还有，sf9的细胞电泳，你们都是怎么处理细胞的？
我的细胞量不是很多，如果提膜来检测膜蛋白的话，就很少了，我试过跑全细胞电泳，但是结果考染后整条带都兰呼呼的，而且带形很难看，不知道是由于脂太多，还是由于核算的干扰？
你们都是怎么处理细胞的，来检测蛋白的？coffejumps wrote:谢谢universea站友的参与，也感谢你的建议。我目前纯化出来的这个蛋白，表达量大约在2-3mg/1*10^8个细胞，还不是很满意。呵呵，这两个酶的效率比较高，放心用！反正后面要鉴定嘛这个状态怎么控制？谈谈你的经验如何？放一个星期都可以？？？晕！细胞破裂死亡不会导致表达蛋白降解吗？你们通常都表达什么性质的蛋白，稳定性如何，表达膜蛋白成功的例子多么？就我自己做的来说吧，扩毒时，一般加毒后到第五天收毒，收毒前如果细胞漂起来的不多，就再等一到两天收毒。表达蛋白就不同了，要摸索时相和加的病毒量，蛋白不同表达时相会不一样。我自己做的一个分泌型蛋白表达还行，不过我用的培基加有FBS，想试试把血清去掉再做做表达。另做了个膜蛋白90kD左右，表达的量很低，正在郁闷中。oktocry wrote:这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？
感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～
我也觉得挺好吹的，好像消化液处理对细胞状态会有一些影响的。
滴度一定要做么？我觉得好麻烦，总不想去做。反正表达的时候不是要做时相跟MOI的么？条件摸好了表达的时候用同一个病毒stock不行么？请问coffejumps 我也在用昆虫细胞sf9和baculovirus表达一个蛋白， 蛋白要么是不合histag结合， 要么是没有活力。 试验室里的人说我表达的是分泌型蛋白，他们只用细胞培养上清做分离纯化，可我怀疑上清中蛋白不够多，也许大部分都在细胞里，怎么确定蛋白是分泌表达还是胞浆表达呢， 是不是是由蛋白本身的特性决定的。 另外我对你的纯化过程非常感兴趣，我最近对一个蛋白进行了几次纯化， 过了histag 的bead,还是有很多条带，能不能介绍介绍纯化过程，非常感谢。本人用BEVS系统在昆虫细胞中表达了一种外源性蛋白酶．从目的基因的克隆，转移表达载体的构建及细胞转染都逐一攻克，positive　control是自己构建的GFP系统，在荧光显微镜下看到了绿色荧光．进一步对表达产物进行生化反应也检测到了生物学活性．但是现在面临产物的分离纯化，毕竟我对蛋白质这块很陌生，简直感觉到无所适从，好象这方面的资料很难找，所以特此向广大战友求助，若有这方面的资料（movie，flash，动画都好）望提供一份，不胜感激．我的邮箱：(1.5G)附上GFP表达情况：
（缩略图，点击图片链接看原图）sheenhl wrote:请问coffejumps 我也在用昆虫细胞sf9和baculovirus表达一个蛋白， 蛋白要么是不合histag结合， 要么是没有活力。 试验室里的人说我表达的是分泌型蛋白，他们只用细胞培养上清做分离纯化，可我怀疑上清中蛋白不够多，也许大部分都在细胞里，怎么确定蛋白是分泌表达还是胞浆表达呢， 是不是是由蛋白本身的特性决定的。 另外我对你的纯化过程非常感兴趣，我最近对一个蛋白进行了几次纯化， 过了histag 的bead,还是有很多条带，能不能介绍介绍纯化过程，非常感谢。分泌性表达是会分泌到上清之中的，所以你检测到上清中有蛋白，就是分泌表达了，如果表达量低，你可以试着将上清浓缩。杆状病毒表达的蛋白比较奇怪，有的很好纯化，有的很难，就是不和Ni-珠结合。可能是因为膜蛋白经表达修饰影响了histag的结合位点。但是如果你的蛋白可以结合，但是有杂带，你可以试着提高wash buffer 中咪唑的浓度，这样可以洗掉杂蛋白，当然随着咪唑浓度的提高，目的蛋白可能也会有一定的损失。因为我最近工作较忙，无法对回帖尽快做出答复，请各位站友见谅，您可以PM我，以便我在第一时间回复。
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