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我以质粒为模板，跑了PCR，为何点样孔会出现很亮的条带？谢谢指点！
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模板加的过多。你可以试试减小模板用量。
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有可能是大肠杆菌的Genomic DNA也被提出来了
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是蛋白吧 质粒不纯
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有两方面原因：一种是胶与梳子之间的结合会造成胶孔径减少，也就是说本来0.7%的胶，在孔局部会形成高于0.7%的密度，因此，一些大分子DNA就被阻挡在孔内；另一种就是如上面网友所说的，有杂质或者模板过多。少加点样清晰度会好些，或者减少胶浓度。
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两个原因，一是可能你提的质粒中还有蛋白，跑胶时蛋白没跑出去，导致很亮。第二，有时候在你拔梳子的时候不恰当，孔会黏在一起，照出反光的效果，结果照出来就很亮。第二种情况我碰到过。如果不影响你PCR的结果就没事的。
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俺觉得，应该是质粒不纯，里面含有蛋白质，蛋白质与DNA形成的复合体，EB导致DNA发光
建议测OD 260/280，看看OD值，如果小于1.6，则很可能有蛋白污染。
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质粒不纯，混有蛋白。可重新用氯仿：异戊醇提纯一次再做PCR
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&最近做融合PCR时也出现类似问题！可能被蛋白污染，你可以测下浓度OD值偏低是被蛋白污染！
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生物秀旗下 [Website]质粒PCR后电泳出现 很多条带 怎么回事_百度知道
质粒PCR后电泳出现 很多条带 怎么回事
提问者采纳
（2）退火温度过低；（3）pcr体系有问题最常见的原因有：（1）引物特异性不好
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质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？
各位大神好！marker从上到下是,00,0.这个电泳图是7584bp的质粒跑的，双酶切的片段50bp，所有整齐像一字的条带都是双酶切的，两条特别的条带是原质粒，原质粒跑成这样能割胶回收吗？
QQ图片&&09 09.jpg
我要割胶回收连接目的片段
是啊 所以才问可不可以割胶回收呢 这个提的质粒做过293T的转染了 有绿色荧光 也做过两个酶切位点的单酶切 都正常 唯有原质粒跑出来的电泳不正常
这个质粒也做过两个酶切位点的分别单酶切 正常 转染过293T 有绿色荧光 重新转化的感受态 涂板 也长出单菌落了 就是这个原质粒跑的电泳不知道是不正常还是没跑开
你一样的个东西整这么多孔干啥？省着点琼脂做果冻吃不好么？这样得切下来多少？后面胶回收一路也是麻烦，一遍遍过柱子不累啊？
切吧，酶切产物大小符合预期
干这个事情，上个没有切的质粒，只是让你看看是不是切了之后跟原始质粒不一样了。质粒在agaraose gel上怎么跑，跑多快，陈词滥调的东西，管他干啥，跟你怎么抽的还有关系呢。你现在区别明显，目的达到，ok
你原质粒多长时间啦
一个星期啊 提了不久
这个说的很有道理，赞
谢谢指点 因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 回首之后连接不出来 图片里是我的连接体系 不知道为什么 若你能帮我分析出问题在哪里 我请你吃好多好多果冻 :D
QQ图片 连接体系.jpg
谢谢 作了对照
谢谢 我也连接了 但是就长出了两个单菌落 不知道是不是杂菌
如果你那两个单克隆没有预期的克隆，可以试着先单酶切一个位点-回收纯化-酶切第二个-回收纯化-连接。& && &回收之前一定跑胶看看是否已经完全线性化，再回收。
字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！
“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”
这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样等于增加了胶体积，降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言，吸附效率与DNA浓度关系很大，越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面，切的时候争取小点。
不过话说回来，一般而言还不至于低到影响连接，所以你这里或许还会有其他问题。
150 ng质粒用于连接，对于一般的片段而言足够了，除非你片段很长，这时候就得计算一下了，一般而言片段需要过量一点。
“回首之后连接不出来”，这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点，我这样说好了，
1，载体双酶切，
如果是空载，掉下来的片段不到80bp以下的，完全可以直接过柱回收，没必要跑胶分离，现在绝大多数公司的内切酶，在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切，一般也不需要脱磷，脱磷对于单酶切而言一般情况下必要，但是对于双酶切，其实可以不做，不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。
2，片段酶切，
片段，即便加上保护碱基，酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言，摩尔数也一般很高，所以酶切经常不彻底，可以稍微多切一会，取决于你用的酶，特别是考虑星号活性。
必须带上不含插入片段只有载体的对照。
一般而言，只要是克隆熟相对于对照有明显区别，都非常有可能拿到阳性克隆，不是说一定要对照少片段多，经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆，直接单酶切平末端的载体，不脱磷连接PCR产物，PCR产物两头没有磷，全靠载体连，那结果就是对照密密麻麻，连接零星几个，这样就对了。
如果连接没长，这时候一定要关注一下对照，如果对照也一个没长，不是说载体做得太好了，而是好过了头，这时候要减少双酶切时间，不要脱磷，增大载体连接量再试。
大多数而言，以上分析能够解决问题，等待你的果冻！~
大神果然是大神，一句话省去我好多工作量，就这个电泳图胶回收我会收到凌晨两点多。我刚进实验室，之前没有师兄师姐做过这方面，现在老师让我建立这个平台体系，可否请教大神扣扣号？以后还希望大神多多指点！你喜欢吃什么牌子什么口味的果冻？地址？我正要去超市。
果冻留着吧，MM做实验不要熬太晚，学会自主学习，寻求帮助，祝实验顺利。
果冻已经买好了，给你寄过去吧，我说过请你吃了，君子一言驷马难追！而且，我有工资，平时花不完，哈哈。已经连接上了，看了很多帖子，自己最后重设了体系，还没送去测序，但是转化效果还不错。多谢指点！
多谢！已经连上了，最后重设了体系，根据这个公式连计算片段和载体分别需要的量。公式是：插入片段体积(μl) = T载体量(ng)x 插入片段大小(kb)÷T载体大小(kb)x插入片段与T载体的摩尔比(3~10:1) ÷ 插入片段浓度(ng/μl)。载体与片段相差不大一般用5:1，大的话就用8:1.
我把你的金玉良言粘贴到word打印出来了 哈哈
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先做的菌落pcr，电泳有目的条带，然后菌液摇过夜提质粒再做双酶切（已经考虑了共用buffer的问题），电泳后提的质粒有条带，但酶切产物没有任何条带，就算质粒没有切动但至少应该有质粒的条带才对啊，但空空如也什么也没有，而且做过好几次，20微升的酶切体系，加了7微升质粒，酶切3小时后把20微升全部用来电泳仍然什么也没有，单独的质粒每次都有条带，酶切产物就什么也没有，连质粒也没有，我快想破脑袋了，由于很多人用一个实验室，现在的我能想到的只有别人在我酶切时把体系换成了自来水，除此之外想不到别的原因了，崩溃啊！谁能想到还有别的原因呢帮帮我啊！
问题补充:(补充时间: 22:10)
首先我配的胶没有问题，因为maker是能跑出来的，而且用没有酶切的质粒做了对照，也能跑出来，唯独是双酶切后跑电泳不仅没有酶切产物，就算没切动也应该有质粒啊，连质粒都没有，最早是用top10做的感受态，然后把酶连产物转化进去，摇菌，然后再提的质粒，质粒再双酶切，就是这样一个程序，会不会是酶切体系被dna酶给污染了呢？可是我想不出哪里会有dna酶，另外我做菌落PCR时是有目的条带的，因为想用双酶切再确定一下，可是却出现了这样诡异的现象，只能求助啊！
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你做胶的浓度，电泳液，还有电泳时间或许都有关，确定一下这些没有问题再想其他原因。
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&&&&&&是不是酶切效率太的低的原因啊，37度酶切效果如果不佳的话可以改一下酶切温度，宝生物那本书上就写了，如果37度酶切效果太低的话，可以降低温度比如30度就能提高效率。
&&&&& 但是你质粒都没跑出来这个问题不好说，你可以切完后拿空载做个对照一起跑跑试试，要是还没条带，而且空载也没条带那就是你的胶有问题了。。。祝你好运！
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出现这种情况很少见，问一下你提的质粒的宿主菌是是什么菌，DH5还是BL21，如果是后者酶切一个小时就够了，长时间可能什么都没有了，但有瀑布样的东西。你的Marker有带吗，就可以知道是不是胶的问题。可以留言，随时解决问题。
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回答者： 一级 一星助者
酶切缓冲液、水最好均换成新的重新作酶切，可能其中哪个时间长了，也可能污染了DNase.
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如果你能确定质粒本身没有问题，酶切时加入的质粒量足够，也能确定琼脂糖电泳时，同时上样的Marker条带清晰，那么，整个酶切过程（或试剂）可能被DNase污染了。
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我也有相同的问题出现 急请大侠指教
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我也出现相同的问题，构建好的表达载体酶切10h后有的切开了，有的连质粒条带都没有。估计是酶切时间太长了
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我曾遇见过同样的问题，做了许多平行实验，最后才发现时菌种的问题。换一批感受态就好了。。
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菌落PCR跑出目的条带但提取菌液质粒跑出其他条带？
小生在做基因重组，目的片段675bp，连接转化后挑菌培养时顺带做了菌落PCR，能够跑出目的条带，但是目的条带不整齐；
菌液过夜后进行PCR，未出条带，后来增加了菌液模板量未跑出，再后来直接离心高温后洗涤菌液来做PCR还是未跑出；
最后才用菌液提了质粒，质粒跑胶证明提出，但是也是条带不整齐（这个可以理解），但是跑PCR硬是出现了不一样的条带，在1000bp左右出现了条带。
为什么菌落跑得出菌液跑不出，菌液提取质粒后条带不是目的条带且不整齐，不得解啊！请各位前辈赐教！
你有病吧！
感谢关注，不过你能够用心看完我的帖子再回复不？
我天天做菌落的，菌液比菌落更容易做。。所以方法不会有什么问题的，问题就出在你的质粒上了
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