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淘豆网网友近日为您收集整理了关于（最新）BD FACSCalibur流式细胞仪的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：（最新）BD FACSCalibur流式细胞仪 FACS101 Handbook - 1 –BD FACSCalibur 流式細胞儀FACS101 Handbook本課程介紹「表面抗原流式分析」有關之基礎工作原理。如希望進一步瞭解流式細胞技術應用,請至本公司網站訂閱 FACSinformation 電子報/bdb/index.html。如需要本課程手冊,歡迎至本公司網站下載/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫螢光染色方法,請至本公司網站下載/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur 基本結構1.1 儀器本體:1. 電源開關:在BD FACSCalibur儀器右側下方,先啟動儀器本體,再打開電腦。2. 光學系統:BD FACSCalibur 基本配有一支波長488 nm 的氬離子雷射以BD FACSCalibur 基本型為例 FSC Diode 只收488 nm波長散射光 SSC PMT 只收488 nm波長散射光 FL1 PMT 螢光光譜峰值落在綠色範圍(波長515-545 nm) FL2 PMT 螢光光譜峰值落在橙紅色範圍(波長564-60(来源：淘豆网[/p-.html])6 nm) FL3 PMT 螢光光譜峰值落在深紅色範圍(波長&650 nm)FACS101 Handbook - 2 –3. 儀器面板:儀器前方面板的右下方有三個流速控制鍵、及三個功能控制鍵。流速控制:LO: 樣品流速:12 l /minMED:樣品流速:35 l /minHI: 樣品流速:60 l /min功能控制: RUN:此時上樣管加壓,使細胞懸液從進樣針進入流動室。(正常顯示綠色;黃色時表示儀器不正常,請檢查是否失壓。) STANDBY:無樣品或暖機時之正常位置,此時鞘液停止流動,雷射功率自動降低。 PRIME:去除流動室中的氣泡,流動室施以反向壓力,將液流從流動室沖入樣品管,持續一定時間後,以鞘液回注滿流動室。PRIME 結束,儀器恢復 STANDBY 狀態。4. 儲液箱抽屜:在主機左下方之儲液箱抽屜。可向前拉開,內含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾器Sheath Filter,及空氣濾網 Air filter。請注意氣路減壓閥VENT TOGGLE之位置。FACS101 Hand(来源：淘豆网[/p-.html])book - 3 –鞘液筒:位於抽屜左側,容積 4 升。裝八分滿鞘液筒,儀器可以運行大約 3小時。筒上裝有液面感應器,鞘液用完時,儀器軟體上會有顯示。鞘液筒蓋上有金屬環扣,保證鞘液筒密閉。廢液筒:位於抽屜右側,容積 4 升。筒上裝有液面感應器,廢液盛滿時,儀器軟體上會有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。鞘液過濾器:0.22m 過濾器,去除鞘液中的雜質,保證進入流動室的鞘液是乾淨的。氣路減壓閥:沿箭頭方向移動閥門開關,鞘液筒減壓,氣壓恢復正常。在鞘液筒添加鞘液時,需要減壓。空氣過濾網:用於過濾冷卻雷射的空氣。5. 上樣品區:上樣品區是樣本管的上樣位置。它包括三個部分,一個是進樣針 Sample Injection Tube,將樣本輸入流動室,還有就是支撐架 TubeSupport Arm、和液滴存留系統 DropletContainment System。進樣針:是一根不鏽***管,將細胞從樣本針中吸入流動室。進樣管外有一套管,是液滴保留系統的一部分。支撐架:用於支撐樣本管、並負責啟動液滴存留(来源：淘豆网[/p-.html])系統。支撐架有三個位置:位於樣本管之下的中位,樣本管左側或右側。液滴存留系統:系統由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當支撐架位於左側或右側位置時,真空幫浦就會啟動,將液體從外管吸入廢液筒內。上樣時,須注意將支撐架位於中位,以避免過多樣品被抽吸到廢液筒內(當支撐架位於中位,真空幫浦停止工作)。更換樣品時,讓儀器保持 RUN 的模式,使得進樣針可以反沖;切換到STANDBY 模式前,確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動室中。FACS101 Handbook - 4 –1.2 Macintosh 電腦與印表機:準備您的細胞樣品1. 理想樣品濃度調至 1-10 X 105cells/ml?一般實驗只需 0.5 ml 的樣品。2. 細胞樣品務必放至 BD FALCON 352052 試管中,否則無法上機。3. 上機前務必去除樣品中之細胞團塊,以防止管路堵塞?可使用附濾網 BDFALCON 試管(Cat. No.352235) 或 35-55 m 的尼龍篩網。4. 供流式分析的樣品是單細胞懸浮液,而且大部(来源：淘豆网[/p-.html])分樣品都需經螢光染色。表面抗原螢光染色的方法大致有兩種:直接免疫螢光、間接免疫螢光染色。研究生可至本公司網站下載染色方法/bdb/10-5-4-1.html 直接免疫螢光染色 Lysed - No - Wash Procedure Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure Leukemia and Lymphoma Procedure 1 Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay 間接免疫螢光染色滴定抗體濃度常用試劑5. 如因特殊因素無法下載上述實驗方法,請 e-mail:yenchichen@.tw或 austin_bdtwn@.tw。FACS101 Handbook - 5 –二、開機、關機標準操作2.1 FACS Calibur 開機1. 開啟細胞儀電源。2. (来源：淘豆网[/p-.html])開啟其他周邊配備電源,如印表機及MO機。3. 開啟電腦。4. 確認鞘流液筒有八分滿的FACS Flow,確實旋緊(鞘液筒容量為4L)。5. 將廢液倒掉,並在廢液筒中加入200 ml 家用漂白水(廢液筒容量為4L)。6. 將減壓閥方向調在加壓(Pressurize)位置。7. 排除液流管路與過濾器中的氣泡。8. 取下樣品管,執行 PRIME 功能兩次。9. 使用1ml PBS,HIGH RUN 兩分鐘。10. 可開始分析樣品。2.2 FACS Calibur 關機關機前必要動作:清洗進樣管和外套管,防止進樣管堵塞、或有染料殘留。1. 將樣品支持架左移,取 2 ml FACSClean(10%Bleach)上樣品,讓儀器的真空系統抽取約 1 ml 的液體。2. 將樣品支持架回正,按 HI RUN,然後讓 FACSClean 清洗管路10分鐘。3. 按 Standby,取下樣品管,執行 PRIME功能兩次。4. 取 2 ml dH2O,重覆上述步驟1-3。5. 注意最後只留約 1 ml dH2O (来源：淘豆网[/p-.html])在試管中。6. 按 STANDBY 五分鐘,使風扇冷卻雷射後,關閉細胞儀(必要動作,以保護雷射光源。)7. 倒掉廢液,並回填 200 ml漂白水。8. 將減壓閥放在「VENT 漏氣」位置。將鞘流液筒充填至八分滿。9. 退出軟體“File”“Quit”(如有對話選項,選擇“Don‘t save”)。確認退出電腦中所有BD應用軟體,所有數據資料已儲存備份。10. 關閉電腦。“Special”“Shutdown”。FACS101 Handbook - 6 –三、上機分析流程建議首次試機避免進行大量試驗,僅需準備下列樣品。(1)Negative Control(不加任何抗體)。(2)CD3-FITC(FL1 單染)。(3)CD19-PE(FL2 單染)。(4)CD3-FITC /CD19-PE(FL1/FL2 雙染)。3.1 Calibur 開機1. 先開啟細胞儀本體再打開電腦。*秘技 1:如順序相反,儀器和電腦之間無法建立正常通訊,無法執行“connect to cytometer”。解決之道,兩(来源：淘豆网[/p-.html])者都關機、然後以正確方式重開。2. 向前拉開儲液箱抽屜,檢查鞘液筒、廢液筒水量,如需充填鞘液,將減壓閥方向調在 VENT 位置(箭頭方向)。3. 儀器會對鞘流液筒打氣加壓,請確認筒蓋確實旋緊。*秘技 2:將減壓閥方向調在加壓(向前)位置。減壓閥如在 VENT(箭頭方向)位置,按 RUN 功能鍵時將顯示橙黃色(表示儀器不正常,請檢查是否失壓),正常為綠色顯示。3.2 開啟 CellQuest 軟體、編輯實驗文件4. 在蘋果功能表下點擊 CELLQuest 啓動軟體。桌面會出現一’Untitled’實驗文件,可點擊實驗文件的右上角的放大鈕,將實驗文件視窗放大。FACS101 Handbook - 7 –5. 從工具板中點擊散點圖圖示。在實驗文件的空白區點擊,拖曳對角線至適當大小,然後放開滑鼠。出現散點圖對話方框。6. 在出現的散點圖對話方框中點擊 Plot Source,選擇 Acquisition (收取) ,確認 X和 Y 軸參數預設為 FSC-H 1024、SSC-H 1024。在顔色方框(来源：淘豆网[/p-.html])中點擊 ating(收取樣品時,門內細胞將出現顔色)。點擊 OK。此時實驗文件會出現FSC/SSC 散點圖。7. 說明:散點圖(Dotplot),又稱二維散點圖是流式分析最常用圖譜,它可以顯示兩個獨立參數的相互關係。在圖中,橫坐標 X 軸爲為螢光 1 強度的相對值,單位是道數,縱坐標 Y 軸則通常表示螢光 2 或光散射強度的相對值。儀器使用者可因應實驗需求來修改所有圖譜中顯示之參數。第一圖 X 和 Y 軸參數分別設為 FSC-H 1024、SSC-H 1024;第二圖 X 和 Y 軸參數分別設為 FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改動作為輕擊圖譜上 X 和 Y 軸參數,並依需要選擇之(FSC:細胞大小,SSC:細胞折射率,FL1:FITC 綠色螢光,FL2:PE 橙色螢光,FL3:PerCP 紅色螢光)。FACS101 Handbook - 8 –8. 從螢幕上方 Plots 功能表中選擇 Dot Plot 功能,可複製一個同樣大小的散點圖,在出現的對話方框內選擇 X 軸:FL1(来源：淘豆网[/p-.html])-H 1024,Y 軸:FL2-H 1024。點擊 OK,FL1/FL2 的散點圖出現。完成後可將重製圖移至原圖右方。9. 在工具板中選擇四象限工具,在 FL1/FL2 散點圖上拖動 Quadrant 的中心將它設定在(x,y)=(101,101)處,這些象限將指定陰性/陽性區域。建立儀器和電腦之間通訊10. 從 Acquire 功能表中選擇 Connect to Cytometer,此時會出現 AcquisitionControl 對話方框。如果無法選擇 Connect to Cytometer,參考秘技#1。如果沒見到 Acquisition Control 對話,可到螢幕上方 Windows 功能表中選擇 ShowAcquisition Control。儀器設置文件注意:實驗數據品質,取決於最適化儀器設定文件。儀器設定文件不能在數據收取後再更改,研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設定文件。儀器設定文件(Instrument settings),含信號器高壓(Detector/ Amp(来源：淘豆网[/p-.html])s),閾值(Threshold),pensation)等儀器條件的組合。一般而言,儀器設定的順序為 Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。FACS101 Handbook - 9 –11. 檢查現有儀器條件,從 Cytometer 功能表中選擇Detectors/Amps。出現 Detectors/Amps 視窗。在Detectors/Amps 視窗確認 FSC 與 SSC 爲 LIN(線性放大),其他 FL1-3 爲 LOG(對數放大),將其拖至空白區。12. 從 Cytometer 功能表中選擇 Threshold,出現 Threshold 視窗在 Threshold 視窗:確認 FSC 為設閾參數,初步確認預設閾值 52。將其拖至空白區。13. 從 Cytometer pensation,確認所有預設數值皆為零。將其拖至空白區。3.3 上樣品、設置儀器14. 使儀器處於 High RUN,支撐架左移,上陰性對照管樣品,支撐架回位。確認Acquisition Control 視窗中 Setup 前需打叉或打勾(即不儲存資料),點擊Acquire。調節 FSC/SSC 探測器(電壓)15. 觀察 FSC/SSC 圖的變化。FSC 電壓(Voltage)預設為 E00,可調節 Amp Gain從 1.00—9.99 使主要細胞群得以清楚顯示(如細胞較大,將 FSC 電壓設置於E-1;較小細胞,將 FSC 電壓設置於 E01)。調節 SSC 電壓使主要細胞群得以清楚呈現。調節 FSC/SSC 圖的原則,在於能得到一獨立離散的細胞族群,該細胞群不與其他族群、細胞碎片有重疊現象。調整定位後,點擊 AcquisitionControl 視窗中的 Pause。FACS101 Handbook - 10 –Gating 圈選細胞檢品中,常含有大小不同、性質相異的細胞群體。我們常用前方散射與側方散射的二維點陣圖,即散射光圖譜(Scatter Plot),來圈選出不同細胞群的範圍,選擇性顯示出有意義的細胞群體,如下圖圈選白血球之淋巴細胞族群。16. 在工具板中選擇多邊形的 Region,在 FSC/SSC 散點圖上劃定淋巴細胞 R1 區域(如下圖)。分析樣品時,區域內細胞應會呈現成紅色,可移動或改變形狀來圈選有意義的細胞。如果要刪除 R1 區域,您可以在工具列中點選 Gates → Regionlist ,以滑鼠點選 R1,再按 Delete 鍵刪除 R1 區域。刪除 R1 區域後,可用繪圖工具板,重畫 R1。17. 選取希望 Gate 的 FL1/FL2 散點圖,從 Plots 功能表中選擇 Format dot plot。在出現的對話方框內,將 No Gate 改選 G1=R1。點擊 OK。調節 FL1、FL2 的探測器(電壓)18. 點擊 Acquisition Control 視窗中的 Restart。在 Detector/Amps 視窗中調節FL1、FL2 的電壓,使 Negative Control細胞群著落在所選直方圖或散點圖之100--101處。播放器加载中，请稍候...
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