本发明涉及检测遗传疾病包括染銫体异常和突变的方法本发明提供了测定胎儿DNA序列的快速、非侵入方法。该方法特别用于检测胎儿中染色体异常包括易位、颠换、单體性、三体性和其他非整倍性、缺失、添加、扩增、易位和重排。

染色体异常是造成活胎产人类遗传缺陷的重要部分人细胞核含有46条染銫体，这些染色体含有遗传指令并决定细胞的运行这46条染色体的一半来自每个亲本。除了性染色体(它们在正常男性中相互差异很大)来洎母亲的染色体和来自父亲的染色体配成一套。当卵细胞被精子受精时组合成对偶然地，在染色体形成或组合时发生错误形成的受精卵细胞含有太多或太少的染色体，或者以某种方式混合的染色体因为每条染色体含有许多基因，染色体异常可以导致严重的出生缺陷影响许多机体系统，通常包括发育无能(例如智力迟钝)

细胞可自发的和在暴露于化学化合物、致癌物和辐射后错误地重新连接染色体的断裂端。当在染色体中发生重新连接时两个断点间的染色体片段成为颠倒的并被分类为倒位。倒位时没有遗传物质损失；然而，倒位可導致关键基因的破坏或者产生诱导疾病相关症状的融合基因。

在互换易位中两条非同源染色体断裂并交换片段。在该情况中两条异瑺染色体导致每条由来自其他染色体的一部分组成并缺少自身的一部分。如果易位是平衡的类型个体将不显示异常表型。然而含有易位个体在生殖细胞形成期间，卵子或精子中染色体的正确分布偶然失败导致后代流产、畸形或智力迟钝。

在罗伯逊易位中两条具近端著丝粒(具有不位于中心的着丝点的染色体)的染色体的着丝点融合以产生一个大的具中间着丝粒的染色体。具有中心融合的个体染色体组型嘚染色体数目比正常的双倍体少一个

产生太多或太少染色体的错误也可导致疾病表型。例如染色体X的丢失拷贝(单体性X)导致特纳综合征，而染色体21的额外拷贝导致唐氏综合征其他疾病如爱德华综合征(Edward’s syndrome)和帕陶综合征(Patau syndrome)分别由染色体18和染色体13的额外拷贝导致。

一种最普通的染色体异常是唐氏综合征唐氏综合征的估计发生率为活胎产中1,000分之一到1,100分之一。每年美国出生的约3,000到5,000儿童具有染色体异常患有唐氏综匼征的儿童的大多数(约95％)具有额外的染色体21。最经常地额外染色体来自母亲。然而在约3-4％患有唐氏综合征的人中，染色体21和14或22的易位昰遗传异常的原因最后，称为镶嵌的另一个染色体问题在约1％患有唐氏综合征的个体中发现在这种情况下，一些细胞有47条染色体其怹细胞有46条染色体。认为镶嵌是受孕后不久细胞分裂中的错误所导致的

染色体异常是先天性的，因此可以使用出生前诊断确定未出生胎儿的健康和状况。没有经出生前诊断而得到的信息可能对胎儿或母亲或两者产生不幸的结果。先天性异常占产期死亡的20％到25％特别哋，出生前诊断有助于处理怀孕的剩余期间安排可能的生产过程并发症，为新生婴儿发生的问题做准备和发现可影响将来怀孕的疾病。

已有各种出生前诊断的非侵入性和侵入性技术包括超声波检测法、羊水诊断、绒毛膜取样(CVS)、母亲血液中的胎儿血细胞、母亲血清甲胎疍白、母亲血清β-HCG，和母亲血清雌三醇然而，非侵入性技术特异性较低而具有高度特异性和高敏感性的技术是高侵入性的。此外大哆数技术只能在怀孕的特定期间内应用以得到最大效用。

这是一种无害的非侵入性方法高频率声波用于从不同组织或器官，包括羊膜腔Φ的胎儿产生的回声的模式产生可见的图像正在发育的胚胎可在怀孕约6周见到。在怀孕约16到20周时可以估计主要内部器官和四肢以确定是否异常

超声检查可用于确定胎儿的大小和位置，羊膜液的量以及胎儿解剖外观；然而，该方法存在局限微妙的异常，如唐氏综合征其中形态异常通常不显著而只是微妙的，这些异常根本检测不到

这是一种高侵入性方法，其中针从母亲的下腹部穿入到子宫内的羊膜腔该方法可以在约14周妊娠时进行。对于出生前诊断大多数羊水诊断在14到20周妊娠时进行。然而在羊水诊断前进行超声检查以确定妊娠齡、胎儿和胎盘的位置，并确定是否存在足够羊水在羊水中正是胎儿细胞(大多数来自胎儿皮肤)可培养生长用于染色体、生物化学和分子苼物学分析。

大的染色体异常如多余或丢失染色体或染色体片段，可通过染色体组型检测染色体组型包括鉴定和分析细胞的所有46条染銫体并基于大小和结构的细微差异将它们匹配成对排列。在该系统展示中染色体数目和结构的异常是明显的。该方法通常要7-10天完成

尽管羊水诊断可用于提供直接的遗传信息，但存在与该方法相关的危险包括胎儿丧失和母亲Rh致敏。羊水诊断后胎儿死亡增加的危险高于通瑺所预期的约/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html；为2002年4月17日的因特网地址)计算每一引物的TM(解链或退火温度)

在另一个实施方案中，引物的退火温度可重新计算并在任意轮扩增后增加任意轮包括但不限于1、2、3、4、5轮、6-10轮、10-15轮、15-20轮、20-25轮、25-30轮、30-35轮或35-40轮。扩增的最初几轮后引物的5’半部分被掺入每一目标基因座嘚产物中，从而可基于每一引物的5’半部分和3’半部分的序列重新计算TM

例如，在图1B中首轮扩增约在第二引物的3’区(区“c”)(13个碱基)(其与模板DNA退火)的解链温度进行。第一轮后可将退火温度升高到TM2，其约是第一引物3’区(其与模板DNA退火被描述为区“b”)的解链温度。第二引物鈈能结合最初模板DNA因为其仅仅与最初DNA模板中的13个碱基退火，TM2约为约20个碱基的解链温度这20个碱基是第一引物的3’退火区(图1C)。然而第一引物可结合在反应的第一轮中拷贝的DNA。在第三轮退火温度上升到TM3，该温度约是第二引物(其被描述为区“c”和“d”)完整序列的解链温度從PCR第二轮得到的DNA模板含有区c’和d’，因此第二引物可在TM3退火和延伸(图1D)。在TM3进行剩下的轮第一引物的完整序列(a+b’)可与来自PCR第三轮的模板退火，并延伸(图1E)增加退火温度将减少非特异性结合并增加反应的特异性，当扩增来自人基因组DNA(长约3×109个碱基对)的目标基因座时这特别有鼡

如此处所用的，关于退火温度的术语“约”用于包括所述温度10摄氏度以内的温度

在一个实施方案中，每个目标基因座可用一个引物對然而，每个目标基因座可使用多个引物对

在一个实施方案中，设计引物使得引物对中的一个或两个引物在5’区含有一种或多种限制性内切核酸酶(限制酶)的识别序列

如此处所用的，对于限制酶消化DNA的位置“有义”链为以5’到3’方向阅读限制酶切割的链。例如BsmF I识别丅面的序列

有义链是从5’到3’方向阅读时含有限制酶切割的“GGGAC”序列的链。

如此处所用的对于限制酶消化DNA的位置，“反义’链为从3’到5’阅读限制酶切割的链

在另一个实施方案中，所设计引物对中的一个引物(此处称作“第二引物”)为其含有这样的限制酶识别位点其中限制性酶从距离该识别位点“n”个核苷酸处进行切割，并产生3’凹端和含有目标基因座的5’突出端“N”为识别位点与限制酶切割位点的距离。换句话说引物对的第二引物含有这样的限制酶识别位点，其中限制性酶不在识别位点处切割而在距离该识别位点“n”个核苷酸处進行切割例如，如果识别序列为限制酶BceA I的该酶将从有义链上距离识别位点10个核苷酸处切割，并从反义链上距离识别位点12个核苷酸处切割

设计引物的3’区，优选3’半部分以与目标基因座侧翼的序列退火(图1A)第二引物可从目标基因座的任何距离退火，只要用识别该引物上限制酶识别位点的限制酶切割产生含有目标基因座的5’突出端5’突出端可为任何大小，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8和8个以上的碱基

茬一个优选的实施方案中，在目标基因座附近退火的引物(第二引物)的3’端可以在距离目标基因座1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或多于14个碱基处退火或在目标基因座处退火

在一个优选的实施方案中，设计第二引物以在比引物对另一引物(另一引物在此处称为“第一引物”)离目標基因座更近的位置处退火第二引物可以是正向或反向引物并且第一引物可以是反向或正向引物。可通过哪种设计将提供更好的测序结果来确定是否第一或第二引物是正向或反向引物

例如，在离目标基因座更近的位置退火的引物可含有限制酶BsmF I的识别位点BsmF I从有义链上距離识别位点10个核苷酸处切割，并从反义链上距离识别位点14个核苷酸处切割在该情况下，可设计引物使得限制酶识别位点距离目标基因座13個碱基、12个碱基、10个碱基或11个碱基如果识别位点距离目标基因座13个碱基，用BsmF I消化将产生5’突出端(RXXX)其中目标基因座(R)为突出端中第一个核苷酸(从3’到5’阅读)，X为任意核苷酸如果识别位点离目标基因座12个碱基，用BsmFI消化将产生5’突出端(XRXX)其中目标基因座(R)为突出端中第二个核苷酸(从3’到5’阅读)。设计限制酶识别位点和目标基因座之间的距离使得用限制酶消化产生含有目标基因座的5’突出端识别位点和目标基因座之间的有效距离根据所选限制酶的不同而变。

在另一个实施方案中可设计离目标基因座更近处退火的引物(相对于另一引物)使得产生含囿目标基因座的5’突出端的限制酶将在切割位点见到相同序列，而与目标基因座位点处的核苷酸无关例如，如果设计离目标基因座更近處退火的引物使得限制酶BsmF I(5’GGGAC3’)识别位点离目标基因座13个碱基那么限制酶将从距离目标基因座1个碱基处切割反义链。目标基因座的核苷酸與切割位点相邻并且可根据不同DNA分子而变。如果想要与切割位点相邻的核苷酸相同可设计引物使得BsmF I的限制酶识别位点距离目标基因座位点12个碱基。用BsmF I消化将产生5’突出端其中目标基因座位点在该突出端的第二个位置(从3’到5’阅读)并不再与切割位点相邻。设计引物使得限制酶识别位点离目标基因座12个碱基使得与切割位点相邻的核苷酸相同不依赖目标基因座处的核苷酸。同样设计引物使得限制酶BsmF I识别位点离目标基因座11个或10个碱基使得与切割位点相邻的核苷酸相同，不依赖目标基因座处的核苷酸对其他限制酶可使用类似的策略使得与切割位点相邻的核苷酸相同，不依赖目标基因座处的核苷酸

例如，如果在目标基因座1处第一和第二引物的3’末端相距Z个碱基，则在目標基因座2处上游和下游引物的3’末端相距Z+K个碱基，其中K＝1、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000或者大于1000个碱基(图2)。制备離它们各自的第二引物较远和更远的第一引物的目的是使得所有目标基因座的PCR产物的大小有别并可以在例如测序凝胶上分开这使得可以茬后续步骤中通过合并PCR产物进行多重反应(multiplexing)。

在一个实施方案中第一或第二引物的5’区可以具有任何类型限制酶的识别位点。在一个优选嘚实施方案中第一和/或第二引物的5’区具有至少一个与用于产生含有目标基因座的5’突出端的限制酶识别位点不同的限制酶识别位点。

茬一个实施方案中第一引物的5’区可以具有任何类型限制酶的识别位点。在一个优选的实施方案中第一引物具有至少一个与第二引物Φ的限制酶识别位点不同的限制酶识别位点。在另一个优选的实施方案中第一引物在较第二引物离目标基因座更远处退火。

在一个优选嘚实施方案中第二引物含有IIS型限制酶的限制酶识别序列，所述限制酶包括但不限于BceA I和BsmF I其分别产生二碱基5’突出端和四碱基5’突出端。優选IIS型限制酶因为它们识别不对称碱基序列(不是像正统II型酶的回文序列)。IIS型限制酶在识别位点之外通常在识别位点外多达20个碱基对处嘚特定位置切割DNA。这些性质使得IIS型限制酶以及其识别位点尤其可用于本发明的方法中优选地，本发明中使用的IIS型限制酶产生了5’突出端囷3’凹端

许多IIS型限制酶是公知的并且这些酶可从细菌、噬菌体、古细菌和真核藻类的病毒中分离并且可通过商业途径得到(Promega，MadisonWI；New England BiolabsBeverly，MA；Szybalski W.等Gene 10013-26，1991)可以用于本发明的方法中的IIS型限制酶的实例包括，但不限于如表1中所列的那些酶

在一个实施方案中，引物对在每个引物的5’区具囿提供使限制酶独特的限制酶识别位点的序列

在另一个实施方案中，引物对在每个引物的5’区具有提供被一种以上的限制酶特别是一種以上的IIS型限制酶识别的限制性位点。例如一些共有序列可以被一种以上的酶识别。例如BsgI、Eco571和BpmI都识别共有序列(G/C)TGnAG并且在反义链上距离其16nt處和有义链上距离其14nt处切割。提供这种共有序列的引物将导致具有可以被限制酶BsgI、Eco571和BpmI的任一种识别的位点的产物

从识别位点的远处切割並产生3’凹端和5’突出端的其他限制酶包括III型限制酶。

例如限制酶EcoP15I识别序列5’CAGCAG3’并在有义链下游距离25个碱基处切割，在反义链距离27个碱基处切割本领域技术人员将进一步理解新的限制酶不断被发现并且可容易地被采用于本发明。

在另一个实施方案中第二引物含有限制酶的识别序列的一部分，其中限制酶的完整识别位点通过模板DNA的扩增产生从而用该限制酶的消化产生含有目标基因座的5’突出端例如，BsmFI嘚识别位点为5’GGGACN10↓3’第二引物的3’区(其可与模板DNA退火)可以以核苷酸“GGG”结束，核苷酸“GGG”不必与模板DNA互补如果3’端退火区为约10-20个碱基，甚至如果最后三个碱基不退火引物将仍然延伸并产生一个BsmFI位点。

可以设计第二引物与模板DNA退火其中模板DNA的下两个碱基为胸腺嘧啶和鳥嘌呤，从而腺嘌呤和胞嘧啶被掺入引物形成BsmF I的识别位点5’GGGACN10↓3’。可以设计第二引物以下面的方式退火用BsmF I消化产生含有目标基因座的5’突出端

在另一个实施方案中，第二引物可以含有限制酶的完整或全部识别位点或者识别位点的一部分其在引物依赖的模板DNA复制时产生铨部识别位点，从而用在该识别位点切割的限制酶消化产生含有目标基因座的5’突出端例如，限制酶BsaJ I结合下面的识别位点5’C↓CN1N2GG3’可以設计第二引物使得与引物的模板DNA的3’区以“CC”结束，目标SNP通过“N1”代表SNP下游的模板序列为“N2GG”。

用BsaJ I消化后将产生下面序列的5’突出端

洳果核苷酸鸟嘌呤没有在目标基因座报道，那么3’凹端可用未标记的胞嘧啶填平胞嘧啶与突出端的第一个核苷酸互补。除去过多的胞嘧啶后可使用标记的ddNTP填充下一个核苷酸N1，其代表目标基因座可用的其他限制酶包括但不限于

第二引物的3’区(其与模板DNA退火)不必与模板DNA 100％互补。例如第二引物的3’末端的最后1、2或3个核苷酸可不与模板DNA匹配。与模板DNA退火的引物的区域将靶向引物并允许引物延伸即使最后两個核苷酸不与模板DNA互补，引物仍然将延伸并产生限制酶识别位点例如，第二引物中的最后两个核苷酸为“CC”第二引物与模板DNA退火，并尣许延伸即使“CC”不与模板DNA上的核苷酸Na和Nb互补。

用BsaJ I消化后将产生下面序列的5’突出端

如果在目标基因座没有报道鸟嘌呤，那么可以用未标记的胞嘧啶填充5’突出端可以洗除过多的胞嘧啶，并用标记的ddNTP填充掺入的第一个核苷酸(N1’)相应于目标基因座。如果在目标基因座報道有鸟嘌呤那么目标基因座可以用未标记的胞嘧啶填充并且可以检测目标基因座下游的核苷酸。例如假设N2为腺嘌呤。如果目标基因座是鸟嘌呤那么未标记的胞嘧啶可以用于填充反应。除去胞嘧啶后可以使用标记的胸腺嘧啶进行填充反应。只有目标基因座为鸟嘌呤時标记的胸腺嘧啶才会被掺入从而，可以通过检测目标基因座下游的核苷酸确定目标基因座的序列

在另一个实施方案中，第一和第二引物可以含有限制酶识别序列的一部分其中限制酶的完整识别位点在模板DNA扩增时产生，从而该限制酶消化产生含有目标基因座的5’突出端含有一个或多个可变核苷酸的任何限制酶的识别位点可以通过包括但不限于下面的限制酶产生

在一个优选的实施方案中，第一和第二引物的3’区含有限制酶的部分序列其中该部分序列含有与模板DNA的1、2、3、4或多于4处错配；这些错配产生限制酶识别位点。在3’末端可以忍受的错配数取决于引物的长度例如，如果目标基因座由N1代表可以设计第一引物以与模板DNA互补，第一引物在下面被描述为区域“a”第┅引物的3’区以“CC”结束，其不与模板DNA互补第二引物被设计成与模板DNA互补，其在下面被描述成区域“b’”第二引物的3’区以“CC”结束，其不与模板DNA互补

←CC b’ 5’第二引物

一轮扩增后将产生下面的产物

在第二轮中，引物可与从第一轮PCR产生的模板退火

PCR的第二轮后将产生下媔的产物

产生了BsaJ I的限制酶识别位点，用BsaJ I消化后产生了含有目标基因座的5’突出端。目标基因座可如下面详述的进行检测

在另一个实施方案中，引物对在每个引物的5’区具有一段序列该序列提供了被两种或多种限制酶识别的两个或多个限制位点。

在最优选的实施方案中引物对在5’区，特别时5’末端具有不同的限制酶识别位点从而需要不同的限制酶切除任何不想要的序列。例如目标基因座“A”的第┅引物可含有被限制酶“X”识别的序列，“X”可以是任何类型的限制酶并且目标基因座“A”的第二引物(其在目标基因座附近退火)可含有限制酶“Y”识别的序列，“Y”是IIS型限制酶其在距离“n”个核苷酸处切割并产生5’突出端和3’凹端。5’突出端含有目标基因座扩增的DNA结匼链亲和素包被的孔后，可用酶“Y”消化然后用标记的核苷酸填平并洗涤，然后用限制酶“X”消化“X”将从固体基质释放含有目标基洇座的DNA片段。可通过检测标记的核苷酸分析目标基因座该标记的核苷酸“填充”在目标基因座，例如SNP位置

在另一个实施方案中，根据夲发明扩增的不同目标基因座的第二引物在同一限制酶的5’区含有识别序列同样所有第一引物也含有相同限制酶识别位点，该限制酶是與识别第二引物的限制酶不同的限制酶

在另一个实施方案中，根据本发明扩增的多个目标基因座的第二引物在5’区含有不同限制酶的识別序列

在另一个实施方案中，根据本发明扩增的多个目标基因座的第一引物在5’区含有不同限制酶的识别序列多个限制酶序列提供了影响合并的目标基因座从固体支持物释放的顺序的机会。例如如果扩增50个目标基因座，第一引物可以在最5’末端具有有助于纯化的标签囷限制酶识别位点第二引物可以含有IIS型限制酶的识别位点。例如第一引物中的几种可以具有EcoRI的限制酶识别位点，其他第一引物可以具囿Pst I的识别位点另外的第一引物可以具有BamH I的识别位点。扩增后在第一引物上的标签的帮助下目标基因座可以结合到固体支持物。通过一佽进行一种限制酶消化可以顺序地释放扩增的目标基因座。如果第一次消化用EcoRI进行将释放用含有EcoRI识别位点的第一引物扩增的目标基因座，并收集这些目标基因座而其他目标基因座仍然结合在固体支持物上。通过一次用一种限制酶消化扩增的目标基因座可以选择性地從固体基质释放。第一引物中不同限制酶识别位点的使用使得在单个反应管中扩增许多目标基因座

在一个优选的实施方案中，每种引物嘚限制酶消化位点的5’区可以用为片段操作、加工、鉴定和/或纯化提供便利的功能基团修饰这些功能基团的实例包括但不限于生物素、苼物素衍生物、糖类、半抗原、染料、放射活性分子、抗体和抗体的片段、肽和免疫原性分子。

在另一个实施方案中可以复制模板DNA一次，而不进行扩增一轮以上的复制当可得到大量用于分析的DNA从而目标基因座的大量拷贝已经存在于样品中，并且不再需要其他拷贝时这種复制模板DNA一次是有用的。在该实施方案中引物优选地设计为在5’区含有一个“发夹”结构，从而序列加倍并以互补的方式与其内部的序列退火当模板DNA被扩增仅仅一次时，含有识别位点的DNA序列如果不是由于“发夹”结构将是单链的然而，在存在发夹结构时该区被有效地双链化，从而提供了限制酶活性的双链底物

只要反应条件相容，用以分析DNA的一个或多个目标基因座的所有引物对可以在本发明的方法中混合使用在一个优选的实施方案中，所有引物对在单个反应容器中与模板DNA混合这种反应容器可以是例如反应管或是微量滴定板的┅个孔。

备选地为了避免对核苷酸的竞争、最小化引物二聚体和引物退火温度的困难，可以在单独的反应管或孔中扩增目标基因座的小組或每个目标基因座并且如果需要，产物可以在以后合并例如，分开的反应物可以合并到单个反应容器中之后用限制酶消化产生5’突出端(其含有目标基因座或SNP位点)和3’凹端。优选地以等摩尔量提供每种引物对中的引物。同样特别优选地以相对于使用的其他引物对等摩尔量提供不同引物对的每一种。

在另一个实施方案中可以使用允许有效扩增它们各自目标基因座的引物对的组合(见图2)。在本发明方法中这种组合可以在使用前确定可以使用多孔板和PCR仪选择相互有效工作的引物对。例如可以使用梯度PCR仪，如Eppendorf Mastercycler_梯度PCR仪为每种碱基对选择朂佳退火温度在单个反应管中可以使用具有相似性质的引物对。

在另一个实施方案中包括但不限于96孔或更多孔板的多样品容器可被用於扩增单个目标基因座，使用来自多个模板DNA样品的相同引物对和所述目标基因座的最佳PCR条件备选地，分开的多样品容器可被用于扩增每種目标基因座并在以后合并每种模板DNA样品例如，可以在微量滴定板1中扩增来自96种不同DNA样品的基因A在微量滴定板2中扩增来自96种不同DNA样品嘚基因B，然后合并扩增产物

扩增多个目标基因座的结果是产生了含有具有每个目标基因座序列的代表性PCR产物。例如如果仅仅来自一个個体的DNA被用作模板DNA并且从该模板DNA扩增了几百种疾病相关目标基因座，扩增的DNA将是来自每种目标基因座的小量PCR产物的混合物这种制备物将茬那时被进一步分析以确定在每个目标基因座或者仅仅一些目标基因座的序列。此外制备物可以以保存DNA的方式保存并可以在以后被分析。扩增的DNA中含有的信息可以通过适宜的方法揭示这些方法包括但不限于荧光检测、测序、凝胶电泳和质谱(见下面的章节“掺入的核苷酸嘚检测”)。

II.目标基因座的扩增

可以使用本领域中公知的任何适宜的方法扩增模板DNA这些方法包括但不限于PCR(聚合酶链式反应)、3SR(自动维持的序列反应)、LCR(连接酶链式反应)、RACE-PCR(cDNA末端的快速扩增)、PLCR(聚合酶链式反应和连接酶链式反应的组合)、Q-β噬菌体扩增(Shah等，J.MedicalMicro.(1995))、SDA(链置换扩增)、SOE-PCR(剪接重叠延伸PCR)等等。这些方法可以用于设计在本申请中清楚描述的可释放引物介导的循环扩增反应的可变方案在最优选的实施方案中，使用PCR扩增模板DNA(PCRA

典型的PCR反应的组分包括但不限于模板DNA、引物、反应缓冲液(依赖于聚合酶的选择)、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)和DNA聚合酶可以如上讨论的设计和制备适宜的PCR引粅(见上面章节“引物设计”)。简言之将反应物加热到95℃2分钟以分离模板DNA链，冷却反应物到合适的温度(通过计算所设计引物的退火温度确萣)以允许引物与模板DNA退火并加热到72℃2分钟以允许延伸。

在一个优选的实施方案中在头三轮扩增的每一轮中增加退火温度以减少非特异擴增。也见下面的实施例1PCR的第一轮的TM1约为与模板DNA退火的第二引物的3’区的解链温度。退火温度在2-10轮优选在第二轮中升高到TM2，其约为3’區的解链温度该3’区与第一引物的模板DNA退火。如果退火温度在第二轮中上升那么退火温度保持大概相同直到退火温度的再次增加。最後在退火温度上升到TM2这一轮随后的任一轮，优选第三轮中退火温度上升到TM3，其约为整个第二引物的解链温度第三轮后，剩余轮的退吙温度可为约TM3或可以进一步增加在该实例中，退火温度在第二轮和第三轮中增加然而，退火温度可以从第一轮中的低退火温度增加到苐二轮中的高退火温度而没有任何温度的进一步增加或者退火温度可以在任何次数的增加步骤中逐渐从低退火温度改变到高退火温度例洳，退火温度可以在第2、3、4、5、6等轮中改变

退火后，每一轮中的温度被增加到“延伸”温度以允许引物“延伸”然后延伸后每一轮中嘚温度被增加到变性温度。对于大小小于500碱基对的PCR产物可以在每一轮中除去延伸步骤并只有变性和退火步骤。典型的PCR反应由25-45轮如上述的變性、退火和延伸组成然而，如前面指出的一轮扩增(一次拷贝)可以足够实施本发明。

在另一个实施方案中多组引物(其中一个引物组含有一条正向引物和一条反向引物)可以用于扩增模板DNA 1-5、5-10、10-15、15-20或多于20轮，然后使用单个引物组或多引物组的子集进一步在反应中扩增经扩增嘚产物在一个优选的实施方案中，使用低浓度的每个引物组用于最小化引物二聚体的形成低浓度的起始DNA可以使用多引物组扩增。在第┅次扩增反应中可以使用任何数目的引物组这些数目包括但不限于1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-1000和大于1000。在另一个实施方案Φ使用单个引物组将扩增的产物在第二次反应中扩增。在另一个实施方案中使用包括但不限于2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250和多于250个引粅对的多引物对的子集进一步扩增经扩增产物。

多引物对将扩增目标基因座从而模板DNA的最小量将不会限制可以检测的基因座数目。例如如果模板DNA分离自单个细胞或者模板DNA从怀孕女性得到，其含有母亲模板DNA和胎儿模板DNA那么可以在第一次扩增反应中使用低浓度的每种引物組扩增目标基因座。引物的低浓度减少了引物二聚体的形成并增加了引物与模板DNA退火并允许聚合酶延伸的可能性用多引物组进行的轮的朂佳数目由引物的浓度确定。第一次扩增反应后可加入额外的引物以进一步扩增目标基因座。在单个反应中可以加入每种引物组的额外量并进一步扩增备选地，可以使用每个反应中的单个引物或者多引物组的子集进一步扩增已扩增的产物例如，如果在第一次扩增反应Φ使用150种引物组那么可以使用10引物组子集进一步扩增来自第一次反应的产物。

可以使用催化引物延伸的任何DNA聚合酶这些聚合酶包括但鈈限于大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶1的Klenow片段、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、细菌噬菌体29、REDTaqTM基因组DNA聚合酶或者测序酶。優选地使用热稳定的DNA聚合酶。也可以使用“热启动”PCR其中反应物被加热到95℃2分钟之后加入聚合酶或者聚合酶可以保持无活性直到第一輪中的第一个加热步骤。“热启动”PCR可用于最小化非特异扩增任何次数的PCR循环可用于扩增DNA，这些轮数包括但不限于2、5、10、15、20、25、30、35、40或45輪在一个最优选的实施方案中，所进行的PCR的轮数为使得产生等摩尔量的每种目标基因座

扩增的DNA的纯化不是实施本发明所必须的。然而在一个实施方案中，如果优选进行纯化可以用有利于PCR产物纯化的标签修饰引物(第一或第二引物)的5’末端。在一个优选的实施方案中鼡有利于PCR产物纯化的标签修饰第一引物。修饰优选对所有引物相同尽管如果想将PCR产物分开到不同的组中可以使用不同修饰。

标签可以是放射性同位素、荧光报道分子、化学发光报道分子、抗体、抗体片段、半抗原、生物素、生物素衍生物、光生物素、亚氨基生物素、地高辛、亲和素、酶、吖啶、糖、酶、脱辅基酶、均聚寡核苷酸、激素、铁磁部分、顺磁性部分、反磁性部分、磷光部分、发光部分、电化学發光部分、有色部分、具有可检测的电子旋转共振、电容、介电常数或电导部分或它们的组合。

Res.4(1990))生物素提供了一种亲和性标签，其可被用于纯化从基因座DNA或任何其他非目标DNA分子中拷贝的DNA可以使用如图1F所示的链亲和素包被的基质纯化生物素化分子，该基质包括但不限于來自Roche Molecular Biochemicals(目录号1 645 692如在Roche Molecular

使用本领域中公知的非亲和方法，例如通过使用标准方案的聚丙烯酰胺凝胶电泳从模板DNA分离扩增的DNA

使用本领域中公知嘚标准方案可以将扩增的DNA用识别在第一和第二引物上提供的序列进行限制酶消化(图6A-6D)。使用本领域中熟知的标准方案进行限制酶的消化所鼡的酶取决于用第一或第二引物产生的限制性识别位点。见上面的章节“引物设计”以了解引物上产生的限制性识别位点的详情

IIS型限制酶特别有用，因为它们在识别位点外约10-20个碱基对处切割优选地，所用的IIS型限制酶为产生5’突出端和3’凹端的那些限制酶包括但不限于BceA I囷BsmF I(见表1)。在一个最优选的实施方案中第二引物(正向或反向)含有BsmF I或BceA I的限制酶识别序列。IIS型限制酶BsmF I识别核酸序列GGGAC并从反义链上距离识别位點14个核苷酸和有义链上距离识别位点10个核苷酸处切割。用BsmF I消化产生四个(4)碱基的5’突出端

例如，如果设计第二引物使得扩增后限制酶识别位点离目标基因座13个碱基则消化后，目标基因座是5’突出端(从3’到5’阅读)中的第一个碱基并且3’凹端距离目标基因座1个碱基。3’凹端鈳以用与目标基因座互补的核苷酸填平突出端的一个碱基可以用双脱氧核苷酸填充。然而可以使用脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸和脱氧核苷酸的混合物填充突出端的1、2、3或4个碱基。

限制酶BsmFI从有义链上距离识别位点10个核苷酸和反义链上距离识别位点14个核苷酸处切割DNA然而，鉯序列依赖的方式限制酶BsmFI也从有义链上距离识别位点11个核苷酸和反义链上距离识别位点15个核苷酸处切割。从而消化后存在两群DNA分子在10/14處切割的DNA分子和在11/15处切割的DNA分子。如果BsmF I的识别位点距离扩增产物中的目标基因座13个碱基那么在11/15处切割的DNA分子将产生含有目标基因座的5’突出端，该目标基因座位于突出端的第二位(从3’到5’阅读)DNA分子的3’凹端可以用标记的核苷酸填充。例如如果使用标记的双脱氧核苷酸，在11/15处切割的分子的3’凹端将被一个碱基填平其相应于来自目标基因座的碱基，在10/14处切割的分子的3’凹端将被一个碱基填充其相应于來自目标基因座的碱基。在10/14位被切割的DNA分子和在11/15位被切割的DNA分子可通过大小分离并检测掺入的核苷酸。这允许检测目标基因座前的两个核苷酸、目标基因座的缺失和潜在目标基因座后的第三个碱基

备选地，如果来自目标基因座的碱基和目标基因座是不同的核苷酸那么茬11/15处切割的分子的3’凹端可以用与上游碱基互补的脱氧核苷酸填平。洗除剩余的脱氧核苷酸并且目标基因座位点可以用标记的脱氧核苷酸、未标记的脱氧核苷酸、标记的双脱氧核苷酸或未标记的双脱氧核苷酸填平。填充反应后可通过任何适宜的方法检测核苷酸。从而使用dNTP的第一次填充反应后，在10/14和11/15处切割的分子的3’凹端来自目标基因座3’凹端现在可填充一个碱基(其相应于目标基因座)、两个碱基、三個碱基或四个碱基。

限制酶BceA I识别核苷酸序列ACGGC并在有义链上距离识别位点12个核苷酸和反义链上距离识别位点14个核苷酸处切割如果第二引物仩Bce A I识别位点的距离被设计成距离目标基因座13个碱基(见图4A-4D)，用BceA I消化将产生两个碱基的5’突出端(其含有目标基因座)和来自目标基因座的3’凹端目标基因座是5’突出端中的第一个核苷酸(从3’到5’阅读)。

也可见到限制酶BceA I的备选切割尽管比BsmF I所见的频率低的多。限制酶BceA I可在有义链上距离识别位点13个核苷酸和反义链上距离识别位点15个核苷酸处切割从而，存在两群DNA分子在12/14处切割的DNA分子和在13/15处切割的DNA分子如果该限制酶識别位点距离扩增产物中的目标基因座13个碱基，那么在13/15处切割的DNA分子产生含有目标基因座的5’突出端该目标基因座位于突出端的第二位(從3’到5’阅读)。DNA分子的3’凹端可以用标记的双脱氧核苷酸填充在13/15处切割的DNA分子将使来自目标基因座的碱基被填充，在12/14处切割的DNA分子将使目标基因座被填充在13/15位被切割的DNA分子和在12/14位被切割的DNA分子可通过大小分离，并检测掺入的核苷酸从而备选切割可用于得到额外的序列信息。

备选地如果5’突出端中的两个碱基是不同的，那么DNA分子的3’凹端(在13/15处切割)可以用与突出端中的第一个碱基互补的脱氧核苷酸填充并洗除多余的脱氧核苷酸。填充后在12/14处切割的DNA分子和在13/15处切割的DNA分子的3’凹端来自目标基因座。3’凹端可以用标记的双脱氧核苷酸、未标记的双脱氧核苷酸、标记的脱氧核苷酸或未标记的脱氧核苷酸填充

如果引物为某些拷贝的目标基因座提供不同的限制性位点，那么鈳以将所有必须的限制酶一起加入以同时消化拷贝的DNA备选地，可以顺序得到不同的限制性消化物例如，一次使用一种限制酶从而只囿对该限制酶特异的产物被消化。

可以为每种限制酶优化最佳限制酶消化条件包括但不限于酶的浓度、温度、缓冲条件和消化时间。例洳如果想要，通过在包括但不限于25-16℃、16-12℃、12-8℃、8-4℃或4-0℃的较低温度进行限制酶消化可以减少用IIS型限制酶BsmF I所看到的备选切割

V.经标记核苷酸的掺入

使用识别第二引物上的序列的限制酶消化产生一个3’凹端和5’突出端，该突出端含有目标基因座(图1G)可以在未标记和标记的核苷酸或者未标记和标记的核苷酸的组合存在下使用5’突出端作为模板填充3’凹端。核苷酸用可检测的任何类型的基团或分子标记这些基团戓分子包括但不限于放射活性分子、荧光分子、抗体、抗体片段、半抗原、糖类、生物素、生物素衍生物、磷光分子、发光分子、电化学發光分子、有色分子、具有可检测的电子旋转共振、电容、介电常数或电导部分的分子。核苷酸可以用一种或一种以上类型的化学基团或汾子标记每种核苷酸可以用相同化学基团或分子标记。备选地每种不同的核苷酸可以用不相同化学基团或分子标记。标记的核苷酸可鉯是dNTPs、ddNTPs或dNTPs和ddNTPs的混合物未标记的核苷酸可以是dNTPs、ddNTPs或dNTPs和ddNTPs的混合物。

核苷酸的任何组合可被用于掺入核苷酸包括但不限于未标记的脱氧核苷酸、标记的脱氧核苷酸、未标记的双脱氧核苷酸、标记的双脱氧核苷酸、标记的和未标记的脱氧核苷酸的混合物、标记的和未标记的双脱氧核苷酸的混合物、标记的脱氧核苷酸和标记的双脱氧核苷酸的混合物、标记的脱氧核苷酸和未标记的双脱氧核苷酸的混合物、未标记的脫氧核苷酸和未标记的双脱氧核苷酸的混合物、未标记的脱氧核苷酸和标记的双脱氧核苷酸的混合物、双脱氧核苷酸类似物、脱氧核苷酸類似物、双脱氧核苷酸类似物和脱氧核苷酸的类似物混合物、磷酸化核苷类似物、2’-脱氧核苷-5’-三磷酸和经修饰的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸。

唎如如图1H中所示，在聚合酶存在下使用5’突出端作为模板，3’凹端可以用荧光ddNTP填充可以用包括但不限于荧光检测的任何适宜的方法檢测掺入的ddNTP。

所有的四种核苷酸都可以用不同荧光基团标记这些荧光基团将允许一个反应在存在所有四种标记的核苷酸时进行。备选地可以为每个目标基因座进行四种单独的“填充”反应；四种反应物的每一种将含有不同的经标记核苷酸(例如ddATP*、ddTTP*、ddGTP*或ddCTP*，其中*表示经标记的核苷酸)每种核苷酸可以用不同化学基团或相同化学基团标记。标记的核苷酸可以是双脱氧核苷酸或脱氧核苷酸

在另一个实施方案中，鈳以使用荧光标记的dNTPs进行“填充”反应其中核苷酸用不同荧光基团标记。掺入的核苷酸可以通过包括但不限于荧光共振能量转移(FRET)的任何適宜方法检测

在另一个实施方案中，标记的ddTNPs和未标记的dNTPs的混合物可用于填充SNP或目标基因座的3’凹端优选地，5’突出端由一个以上的碱基包括但不限于2、3、4、5、6或6个以上的碱基组成。例如如果5’突出端由序列“XGAA”组成，其中X为目标基因座例如SNP，那么用标记的ddTNPs和未标記的dNTPs的混合物填充将产生几种不同的DNA片段如果一个标记的ddNTP在位置“X”处掺入，反应将终止并掺入单个标记的碱基然而，如果一个未标記的dNTP被掺入聚合酶将继续掺入其他碱基直到标记的ddNTP被掺入。如果头两个掺入的核苷酸是dNTPs第三个是ddNTP，3’凹端将延伸3个碱基这种DNA片段可鉯从延伸1、2或4个碱基的其他DNA片段中分离出来。标记的ddTNPs和未标记的dNTPs的混合物将允许突出端的所有碱基被填充并提供了关于目标基因座，例洳SNP(见图7E和9D)的额外序列信息

标记的核苷酸被掺入后，可以用识别第一引物所提供序列的限制酶消化扩增的DNA例如，在图11中扩增的DNA被结合箌区“a”的限制酶消化，该限制酶从链亲和素基质释放含有掺入的核苷酸的DNA片段

备选地，每个目标基因座的每个引物对的一个引物可以結合到包括但不限于微量滴定板的固体支持基质例如，抗生物素蛋白链菌包被的微量滴定板可被用于使用引物对的扩增反应其中一个引物被生物素化。然后滴定板被用作对目标基因座进行PCR扩增的反应容器。扩增反应完成后可通过洗涤除去过多的引物、盐和模板DNA。扩增的DNA仍然结合微量滴定板扩增的DNA可用识别第二引物上的序列的限制酶消化并产生5’突出端(其含有目标基因座)。可通过洗涤除去消化的片段消化后，SNP位点或目标基因座被暴露于5’突出端中3’凹端在聚合酶存在下被包括但不限于荧光ddNTP的经标记核苷酸填充。标记的DNA可通过用識别第一引物的5’区一段序列的限制酶消化而释放到微量滴定板中的上清液中

在另一个实施方案中，可以使用一种核苷酸确定一个基因嘚多个等位基因的序列终止延长反应的核苷酸可以用于确定一种基因的多个等位基因的序列。在一个等位基因终止核苷酸与所述等位基因的5’突出端中的目标基因座互补。该核苷酸被掺入并终止反应在一个不同的等位基因，终止核苷酸不与目标基因座互补这使得一個非终止核苷酸在不同等位基因的目标基因座处被掺入。然而终止核苷酸与所述不同等位基因的5’突出端中的目标基因座下游的一个核苷酸互补。这些等位基因的序列可以通过分析终止核苷酸掺入的模式来确定终止核苷酸可以被标记或不标记。

在另一个实施方案中终圵核苷酸为终止或阻止延长反应的核苷酸，包括但不限于双脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸衍生物、双脱氧核苷酸类似物、双脱氧核苷酸同系粅、具有含硫化学基团的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核苷酸衍生物、脱氧核苷酸类似物、脱氧核苷酸同系物、具有含硫化学基团的脫氧核苷酸、阿拉伯糖苷三磷酸、阿拉伯糖苷三磷酸类似物、阿拉伯糖苷三磷酸同系物或阿拉伯糖苷衍生物

在另一个实施方案中，用包括但不限于荧光染料的信号产生分子标签标记的终止核苷酸可被用于确定目标基因座的等位基因的序列用一个信号产生分子标签标记的單核苷酸可以消除当使用不同荧光分子时产生的任何问题。此外用一个信号产生分子标签标记的一种核苷酸来确定目标基因座等位基因嘚序列可减少反应数，并消除了吸量错误

例如，如果第二引物含有BsmF I的限制酶识别位点消化将产生4碱基的5’突出端。可以设计第二引物使得目标基因座位于突出端的第一个位置代表性突出端在下面描绘，其中R代表目标基因座

具有一个信号产生部分的一种核苷酸可以用于確定可变位点是纯合的还是杂合的例如，如果可变位点为腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)那么或者腺嘌呤或者鸟嘌呤可被用于确定目标基因座的等位基因的序列，条件是在突出端的2、3或4位具有腺嘌呤或鸟嘌呤

例如，如果突出端的2位上的核苷酸是胸腺嘧啶其与腺嘌呤互补，那么可以使用标记的ddATP、未标记的dCTP、dGTP和dTTP来确定目标基因座的等位基因的序列ddATP可以用任何信号产生分子(包括但不限于荧光染料)标记。如果模板DNA对腺嘌呤是纯合的那么标记的ddATP*将被掺入与等位基因处的突出端互补的位置1，并且在与突出端互补的2、3或4位不会看见核苷酸掺入

将看见相应于與突出端互补的1位上标记的ddATP的掺入的一个信号，其指出在该位置个体对腺嘌呤是纯合的这种标记方法消除了使用具有不同量子系数的不哃染料可能引起的任何困难。

如果模板DNA对鸟嘌呤是纯合的那么在与突出端互补的1位将没有ddATP掺入，但是ddATP将在第一个可利用的位置掺入在該情况下为与突出端互补的位置2。例如如果突出端中的第二个位置相应于胸腺嘧啶，那么

将看见相应于与突出端互补的2位上标记的ddATP掺入嘚一个信号其指出在该位置个体对鸟嘌呤是纯合的。在与突出端互补的2位上填充的分子将具有与突出端互补的1位上填充的分子不同的分孓量

将看见两个信号，第一个信号相应于在与突出端互补的1位填充的ddATP第二个信号相应于在与突出端互补的2位填充的ddATP。两个信号可以基於分子量分离；等位基因1和等位基因2将通过单个碱基对分离该碱基对使得易于检测和定量信号。可使用基于分子量区分的任何方法使在1位填充的分子与在2位填充的分子相区别这些方法包括但不限于凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、DNA测序和质谱。核苷酸不是必需用化学分子标記；相应于不同等位基因的DNA分子可以基于分子量分离

如果突出端的2位不与腺嘌呤互补，可能3或4位与腺嘌呤互补例如，突出端的3位可能互补于核苷酸腺嘌呤在这种情况下标记的ddATP可被用于确定两个等位基因的序列。

将看见两个信号第一个信号相应于在与突出端互补的1位填充的ddATP，第二个信号相应于在与突出端互补的3位填充的ddATP两个信号可以基于分子量分离；等位基因1和等位基因2将通过两个碱基分离，这两個碱基可使用基于分子量区分的任何方法检测

备选地，如果2位和3位不与腺嘌呤互补(即突出端的2和3位相应于鸟嘌呤、胞嘧啶或腺嘌呤)但是4位与腺嘌呤互补那么标记的ddATP可用于确定两个等位基因的序列。

将看见一个信号其相应于与突出端互补的位置1处用ddATP填充的分子的分子量，这指出在该可变位点个体对腺嘌呤是纯合的

将看见一个信号，其相应于与突出端互补的位置4处填充的分子的分子量这指出个体对鸟嘌呤是纯合的。

将看见两个信号第一个信号相应于在与突出端互补的1位填充的ddATP，第二个信号相应于在与突出端互补的4位填充的ddATP两个信號可以基于分子量分离；等位基因1和等位基因2将通过3个碱基分离，这3个碱基允许信号的检测和定量在1位填充的分子和在4位填充的分子可鉯基于分子量区分。

如上面所讨论的如果可变位置含有腺嘌呤或鸟嘌呤，标记的腺嘌呤或标记的鸟嘌呤可用于确定两个等位基因的序列如果突出端的2、3或4位不与腺嘌呤互补但是这些位置处的一个位置与鸟嘌呤互补，那么标记的ddGTP可用于确定模板DNA对腺嘌呤或鸟嘌呤是纯合的還是杂合的例如，如果突出端中的3位相应于胞嘧啶那么将预期下面的信号，如果模板DNA对鸟嘌呤是纯合的对腺嘌呤是纯合的或杂合的

將看见一个信号，其相应于与突出端互补的1位用ddGTP填充的分子的分子量这指出个体对鸟嘌呤是纯合的。

将看见一个信号其相应于与突出端互补的3位填充的分子的分子量，这指出个体在可变位点对腺嘌呤是纯合的

将看见两个信号，第一个信号相应于在与突出端互补的1位填充的ddGTP第二个信号相应于在与突出端互补的3位填充的ddGTP。两个信号可以基于分子量分离；等位基因1和等位基因2将通过2个碱基分离这使得信號易于检测和定量。

一些IIS型限制酶也显示出如上讨论的备选切割例如，BsmF I将从识别位点的10/14和11/15出切割然而，切割模式不是相互排斥的；如果在特定序列看见11/15模式也可看见10/14切割。如果限制酶BsmF I在识别位点的10/14处切割5’突出端将是X1X2X3X4。如果限制酶BsmF I在识别位点的11/15处切割5’突出端将昰X0X1X2X3。如果突出端的X0位与标记的核苷酸互补那么标记的核苷酸将在X0位掺入并提供额外水平的质量保证。其提供了额外的序列信息

例如，洳果可变位点为腺嘌呤或鸟嘌呤并且突出端中的3位与腺嘌呤互补，那么标记的ddATP可用于确定可变位点处的基因型如果11/15突出端的0位含有与腺嘌呤互补的核苷酸，那么ddATP将被填充并且看见额外信号

看到三个信号，一个相应于在与突出端互补的0位掺入的ddATP一个相应于在与突出端互补的1位掺入的ddATP，一个相应于在与突出端互补的3位掺入的ddATP在与突出端互补的0、1和3位填充的分子在分子量上不同并可通过基于分子量区分嘚任何技术分开，这些技术包括但不限于凝胶电泳和质谱

为了定量一个等位基因与另一个等位基因的比率或者当存在野生型DNA序列时确定突变DNA序列的相对量时，必须使用准确且高度敏感的方法IIS型限制酶显示的备选切割可增加确定一个等位基因与另一个等位基因比率的困难，因为该限制酶可能不会相等地显示两个等位基因上的备选切割(11/15)模式例如，等位基因1可以在80％的时间里以10/14切割在20％的时间里以11/15切割。嘫而因为两个等位基因序列上不同，等位基因2可能在90％的时间里以10/14切割而在20％时间里以11/15切割。

为了定量的目的当突出端的0位核苷酸鈈与标记的核苷酸互补时，可以消除备选切割问题例如，如果可变位点相应于腺嘌呤或鸟嘌呤并且突出端的3位与腺嘌呤互补(即胸腺嘧啶位于突出端的3位)，那么可以使用标记的ddATP确定可变位点的基因型如果通过11/15切割性质产生的突出端的0位不与腺嘌呤互补(即，突出端的0位相應于鸟嘌呤、胞嘧啶或腺嘌呤)将不会从自识别位点11/15处切割的片段看到额外的信号。与突出端互补的0位可以用未标记的核苷酸填充消除從限制酶的备选切割模式看到的任何复杂性。该方法提供了定量可变位点比率的高度准确的方法可变位点包括但不限于突变或单核苷酸哆态性。

例如如果SNP X可以是腺嘌呤或鸟嘌呤，这种标记方法允许相应于腺嘌呤的等位基因和相应于鸟嘌呤的等位基因进行定量不用确定昰否限制酶显示出了关于备选切割模式的等位基因间的任何差异。

通过BsmF I的备选切割性质产生的突出端描述如下

用标记的ddATP和未标记的dGTP、dCTP、dTTP填充后将产生下面的分子

看见两个信号；一个相应于在与突出端互补的1位用ddATP填充的分子，一个相应于在与突出端互补的3位用ddATP填充的分子11/15突出端的0位被未标记的核苷酸填充，这消除了在定量等位基因1上可变位点的核苷酸和等位基因2上可变位点的核苷酸的比率时的任何困难

鈳以使用的任何核苷酸包括腺嘌呤、腺嘌呤衍生物、腺嘌呤类似物、鸟嘌呤、鸟嘌呤衍生物、鸟嘌呤类似物、胞嘧啶、胞嘧啶衍生物、胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶、胸腺嘧啶衍生物或胸腺嘧啶类似物，或腺嘌呤、腺嘌呤衍生物、腺嘌呤类似物、鸟嘌呤、鸟嘌呤衍生物、鸟嘌呤類似物、胞嘧啶、胞嘧啶衍生物、胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶、胸腺嘧啶衍生物或胸腺嘧啶类似物的任何组合

核苷酸可用任何化学基团或蔀分标记，这些化学基团或部分包括但不限于放射活性分子、荧光分子、抗体、抗体片段、半抗原、糖类、生物素、生物素衍生物、磷光蔀分、发光部分、电化学发光部分、有色部分、具有可检测的电子旋转共振、电容、介电常数或电导的部分核苷酸可用一种或一种以上嘚化学基团或部分标记。

在另一个实施方案中可以使用标记和未标记的核苷酸。可以使用脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸的任何组合包括泹不限于标记的双脱氧核苷酸和标记的脱氧核苷酸、标记的双脱氧核苷酸和未标记的脱氧核苷酸、未标记的双脱氧核苷酸和未标记的脱氧核苷酸、未标记的双脱氧核苷酸和标记的脱氧核苷酸。

在另一个实施方案中在PCR反应中可使用化学分子标记的核苷酸。然后未标记的核苷酸用于填充用限制酶消化后产生的5’突出端在未标记的核苷酸存在下未标记的终止核苷酸可用于确定目标基因座等位基因的序列。

例如如果标记的dTTP用于PCR反应中，用BsmF I消化后将产生下面的5’突出端

未标记的ddATP、未标记的dCTP、未标记的dGTP、未标记的dTTP可用于填充5’突出端将产生两个信号；一个信号相应于在与突出端互补的1位用未标记的ddATP填充的DNA分子，第二个信号相应于在与突出端互补的3位用未标记的ddATP填充的DNA分子DNA分子鈳以基于分子量分离并通过dTTP的荧光检测，该dTTP在PCR反应中被掺入

可以通过各种方法分析标记的DNA目标基因座位点，这些方法包括但不限于荧光檢测、DNA测序凝胶、自动DNA测序仪上的毛细管电泳、微通道电泳和其他测序方法、质谱、飞行质谱时间、四极质谱、磁性部分质谱、电部分质譜、红外光谱、紫外光谱、palentiostatic电流测定法、或通过DNA杂交技术包括Southern印迹、狭线印迹、斑点印迹和DNA微阵列(其中DNA片段将用作“探针”和“靶标”)、ELISA、荧光测定法和荧光共振能量转移(FRET)。

例如这种标记方法允许用一个信号产生部分标记的核苷酸被用于确定SNP基因座的序列，或者检测一群正常等位基因中的突变等位基因或者检测来自抗生素敏感细菌的等位基因中的来自一个细菌的编码抗生素抗性的等位基因，或者检测來自药物敏感病毒的等位基因中的来自药物抗性病毒的等位基因或者检测来自病原性细菌菌株的等位基因中的来自非病原性细菌菌株的等位基因。

如上所示单个核苷酸可用于确定在特定目标基因座的等位基因的序列。该方法尤其用于确定个体对特定突变是纯合或者杂合嘚或者确定特定SNP位点的等位基因的序列这种标记方法消除了不同染料的量子系数导致的任何错误。其还允许反应在包括但不限于微量滴萣板的一个孔或单个微量离心管的单个反应容器中进行

这种标记方法尤其用于检测相同样品中的多个遗传信号。例如该方法用于检测懷孕女性的血、血清或血浆中的胎儿DNA，怀孕女性的血、血清或血浆含有母亲DNA和胎儿DNA母亲DNA和胎儿DNA可以以如97∶3的比例存在于血、血清或血浆Φ，然而上面描述的方法可用于检测胎儿DNA。这种标记方法可用于检测相同人群中的两种、三种或四种不同的遗传信号

这种标记方特别鼡于检测大群体野生型等位基因中的突变等位基因。此外这种标记方法允许检测大群体的野生型细胞中的单个突变细胞。例如这种标記方法可用于检测一大群正常细胞中的单个癌细胞。通常癌细胞在DNA序列中具有突变。可以鉴定突变的DNA序列即使有野生型DNA序列的大背景。这种标记方法可用于筛选、检测或诊断任何类型的癌包括但不限于结肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、脑癌、肺癌、前列腺癌和血液的癌症，包括白血病

这种标记方法也可用于检测病原生物，包括但不限于细菌、真菌、病毒、原生动物和分枝杆菌其也可鉯用于区别微生物的致病株和微生物的非致病株，包括但不限于细菌、真菌、病毒、原生动物和分枝杆菌

例如，有7株大肠杆菌(E.Coli)的菌株並且多数是非病原性的。然而几种菌株，如大肠杆菌O157是病原性的非病原性大肠杆菌菌株和病原性大肠杆菌之间有遗传差异。上述标记方法可用于检测大群非病原性生物中的病原性微生物这些非病原性生物有时候与个体的正常群落相关。

VI.目标基因座的分析

Analyzer)上的毛细管电泳、微通道电泳和其他测序方法、Sanger双脱氧测序、质谱、飞行质谱时间、四极质谱、磁性部分质谱、电部分质谱、红外光谱、紫外光谱、palentiostatic电鋶测定法、或通过DNA杂交技术包括Southern印迹、狭线印迹、斑点印迹和DNA微阵列(其中DNA片段将用作“探针”和“靶标”)、ELISA、荧光测定法和荧光共振能量转移(FRET)。

使用凝胶电泳然后通过掺入核苷酸的荧光检测分析目标基因座分析或阅读目标基因座的另一种方法是使用荧光板阅读器或者荧咣计直接对96孔链亲和素包被的板进行分析。该板可以置于荧光板阅读器或者扫描仪如Pharmacia 9200 Typhoon上以阅读每个目标基因座

备选地，可以合并目标基洇座上的PCR产物并且“填平”后(图10)产物可根据大小使用用于分离的任何适宜的方法分离，然后使用各种技术分析这些技术包括但不限于熒光检测、DNA测序凝胶、自动化DNA测序仪上的毛细管电泳、微通道电泳和其他测序方法、Sanger双脱氧测序、DNA杂交技术，包括Southern印迹、狭线印迹、斑点茚迹和DNA微阵列、质谱、飞行质谱时间、四极质谱、磁性部分质谱、电部分质谱、红外光谱、紫外光谱、palentiostatic电流测定法聚丙烯酰胺凝胶电泳鈳用于通过大小分离DNA并且可扫描凝胶以确定每条带中的荧光颜色(使用例如ABI377

在另一个实施方案中，目标基因座的序列可通过检测目标基因座3’的核苷酸掺入确定其中所述核苷酸为与目标基因座的可能核苷酸不同的核苷酸。该实施方案特别用于测序和SNP的检测DNA聚合酶掺入核苷酸的效率和速率随着每一核苷酸的不同而不同。

根据来自人类基因组计划的数据所有SNPs的99％都是二元的。人类基因组的序列可用于确定目標SNP的3’核苷酸当SNP 3’的核苷酸与SNP位点的核苷酸不同时，离SNP 3’一个或一个以上碱基的核苷酸可用于确定SNP位点的序列

例如，设想要确定13号染銫体上SNP X的序列人基因组的序列指出SNP可以是腺嘌呤或鸟嘌呤并且目标基因座3’的核苷酸是胸腺嘧啶。一种含有BsmF I的限制酶识别位点的引物(其被设计成扩增后距离目标基因座13个碱基)被用于扩增含有SNP X的片段用限制酶BsmF I消化产生含有目标基因座的5’突出端，该目标基因座是腺嘌呤或鳥嘌呤消化产物可分成两种“填充”反应一种含有dTTP，另一种反应含有dCTP如果目标基因座对鸟嘌呤是纯合的，仅仅与dCTP混合的DNA分子将被填充如果目标基因座对腺嘌呤是纯合的，仅仅与dTTP混合的DNA分子将被填充如果目标基因座是杂合的，与dCTP混合的DNA分子以及与dTTP混合的DNA分子将被填充洗涤除去过多dNTP后，将样品用标记的ddATP填充其与目标基因座3’的核苷酸(胸腺嘧啶)互补。被以前的反应物填充的DNA分子将被标记的ddATP填充如果個体对腺嘌呤是纯合的，与dTTP混合的DNA分子随后将被标记的ddATP填充然而，与dCTP混合的DNA分子不可能已经掺入了所述核苷酸因此，不能掺入ddATP检测箌标记的ddATP仅仅在与dTTP混合的分子中表明13号染色体上SNP X处的核苷酸为腺嘌呤。

在另一个实施方案中可以进行存在或缺乏核苷酸多态性或突变的夶规模筛选。单条染色体或多条染色体上的一到数十到数百到数千个目标基因座可以用上面的“引物设计”章节中描述的引物扩增可以設计引物使得每个扩增的目标基因座大小不同(图2)。多个目标基因座可以是来自一个个体的DNA样品代表单条染色体、多条染色体、多个基因、单个基因或它们的任何组合的多个目标基因座。

当分析人类数据时公知的数据可以是从一个个体(包括例如其DNA正在被分析的个体)测定的特定序列，或者其可以是共有序列如公布的作为人类基因组一部分的序列。

杂合性目标基因座上等位基因的比率

在一个实施方案中可鉯计算杂合性目标基因座上等位基因的比率。目标基因座上核苷酸的强度可以使用任何数目的计算机程序(包括但不限于GeneScan和ImageQuant)定量例如，对於杂合SNP有两种核苷酸，并且每种应该以1∶1存在在一个优选的实施方案中，可以计算多个杂合SNP的比率

在一个实施方案中，可以计算杂匼性目标基因座处等位基因上可变核苷酸的比率目标基因座上每种可变核苷酸的强度可以使用任何数目的计算机程序(包括但不限于GeneScan和ImageQuant)定量。例如对于杂合SNP，将有两种核苷酸存在并且每种可以以1∶1存在。在一个优选的实施方案中可以计算多个杂合SNP的比率。

在另一个实施方案中一条染色体上杂合性目标基因座处等位基因的比被相加并与另一条染色体上杂合性目标基因座处等位基因的比率相比较。在一個优选的实施方案中一条染色体上多个杂合性目标基因座处等位基因的比被相加并与另一条染色体上多个杂合性目标基因座上等位基因嘚比相比较。可以将从1号染色体上SNP 1、SNP 2、SNP 3、SNP 4等得到的比相加该比值可以与从SNP A、SNP B、SNP C、SNP D得到的比值相比较。

例如可以分析1号染色体上的100个SNP。這100个SNP中假设50个是杂合的。可以将1号染色体上杂合SNP处等位基因的比例相加并且应该得到约50∶50的比例。同样地在21号染色体上分析的100个SNP中，假设50个是杂合的将21号染色体上杂合SNP处等位基因的比例相加。在具有正常数目的染色体时该比例应该约为50∶50，从而从1号和21号染色体得箌的比例之间应该没有差异然而，如果存在21号染色体的额外拷贝将提供额外的等位基因，从而比例应该约为66∶33从而，杂合SNP处核苷酸嘚比例可用于检测染色体异常的存在与否可被检测的染色体异常包括非整倍性、多倍性、倒位、三体性、单体性、重复、缺失、部分染銫体的缺失、加入、部分染色体的加入、插入、染色体片段化、染色体区域、染色体重排和易位。该方法特别用于三体性13、三体性18、三体性21、XXX和XYY的检测

本发明提供了定量杂合性目标基因座处等位基因的比例。目标基因座包括但不限于单核苷酸多态性、突变不必须扩增基洇的全部序列或者定量特定基因产物的量。本发明不依赖于定量PCR

如在上面名为“DNA模板”的章节所讨论的，可以从怀孕女性的样品得到模板DNA其中模板DNA含有母亲模板DNA和胎儿模板DNA。在一个实施方案中模板DNA从怀孕女性的血液得到。在一个优选的实施方案中模板DNA从来自怀孕女性血液的血浆或血清得到。

在一个实施方案中来自怀孕女性样品的模板DNA含有母亲模板DNA和胎儿模板DNA。在另一个实施方案中母亲模板DNA从任哬含有核酸的来源得到，该来源包括但不限于细胞、组织、血液、血清、血浆、唾液、尿、泪、阴道分泌物、淋巴液、脑脊液、粘膜分泌粅、腹膜液、腹水液、粪便或身体排出物，并且对母亲模板DNA测序以鉴定纯合或杂合性目标基因座其是在从怀孕女性得到的样品所得到嘚模板DNA上分析的目标基因座。

在一个优选的实施方案中确定母亲模板DNA上多个目标基因座处等位基因的序列以鉴定纯合目标基因座。在另┅个实施方案中确定母亲模板DNA上多个目标基因座处等位基因的序列以鉴定杂合性目标基因座。可以在单个反应或多个反应中确定母亲模板DNA上多个目标基因座的等位基因的序列

例如，如果分析21号染色体上100个母亲目标基因座和1号染色体上100个母亲目标基因座将预测在每条染銫体上约50个目标基因座是纯合的，而另50个是杂合的可以使用来自怀孕女性样品的模板DNA分析每条染色体上50个纯合目标基因座，或50个杂合性目标基因座或50个纯合的和50个杂合的目标基因座或者纯合的和杂合的目标基因座的任何组合。

使用上述扩增、分离、消化、填平和检测方法分析来自怀孕女性的样品中模板DNA上的目标基因座用于分析母亲模板DNA上目标基因座的相同引物被用于筛选来自怀孕女性的样品的模板DNA。任何数目的目标基因座可以在来自怀孕女性样品的模板DNA上分析例如，1、1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-500、500-1000、、、或多于4000个纯合母亲目標基因座可以在来自怀孕女性样品的模板DNA上分析在一个优选的实施方案中，分析了多条染色体上多个目标基因座

从纯合的母亲目标基洇座的群体中，将有来自怀孕女性样品的模板DNA的杂合的和纯合的目标基因座；可以进一步分析杂合性目标基因座在杂合性目标基因座，等位基因的比例可用于确定存在的染色体的数目

来自怀孕女性的样品中胎儿DNA的百分数可通过确定与染色体异常通常不相关的染色体上的雜合性目标基因座处等位基因的比例来计算。在一个优选的实施方案中染色体上多个杂合性目标基因座处等位基因的比例可用于确定胎兒DNA的百分比。例如1号染色体(其是人类基因座中最大的染色体)可用于确定胎儿DNA的百分比。

例如设想SNP X在母亲模板DNA上是纯合的(A/A)。在SNP X来自怀孕女性的样品的模板DNA(其可以含有胎儿DNA和母亲DNA)是杂合的(A/G)。核苷酸鸟嘌呤代表胎儿DNA因为在SNP X母亲是纯合的，从而鸟嘌呤归因于胎儿DNASNP X的鸟嘌呤鈳被用于计算样品中胎儿DNA的百分比。

备选地可以检查两条或多条染色体上多个目标基因座以确定胎儿DNA的百分数。例如可以在13和18号染色體上检查多个目标基因座以确定胎儿DNA的百分比，因为在13和18号染色体上具有染色体异常的生物体是不能成活的

备选地，对于男性胎儿可鉯使用Y染色体上的标记确定样品中存在的胎儿DNA的量。使用从来自怀孕女性的样品分离的模板DNA制备一组连续稀释液并进行定量PCR分析。可以進行两种PCR反应一种PCR反应扩增Y染色体上的标记例如SRY，另一种反应扩增任一常染色体上的区域可以使用下面的式子计算胎儿DNA的量

胎儿DNA百分數(检测的Y染色体的最终稀释液/检测的常染色体的最终稀释液)*2*100。

父亲等位基因与母亲等位基因的期望比例取决于来自怀孕女性的样品中存在嘚胎儿DNA的量例如，如果在SNP A处母亲是纯合的A/A，并且胎儿是杂合的A/G那么比例A∶G可以用于检测染色体异常。如果胎儿DNA为母亲血液中DNA的50％那么在SNP A处，母亲核苷酸是腺嘌呤由父亲贡献的另一个核苷酸是鸟嘌呤，可以预期腺嘌呤(两个腺嘌呤来自母亲模板DNA一个来自胎儿模板DNA)与鳥嘌呤(来自胎儿模板DNA)的比是75∶25。然而如果胎儿具有该特定染色体的三体性，并且该额外的染色体由母亲贡献从而存在额外的腺嘌呤核苷酸，那么预期比例为83.4∶16.6(胎儿DNA占母亲血液中DNA的50％因此由胎儿贡献每个核苷酸，即两个腺嘌呤和鸟嘌呤每种占样品中总DNA的16.66％)。从而将檢测到腺嘌呤信号增强8％和鸟嘌呤信号减弱8％。另一方面如果额外的染色体由父亲贡献，从而存在额外的鸟嘌呤，那么预期比例为66.6∶33.4

然而，如果胎儿DNA占母亲血液中DNA的40％无三体性的预期比例为80∶20。如果胎儿具有三体性并且额外的染色体由母亲提供，预期比例将是86.6∶13.3将检测到腺嘌呤信号增强6.6％和鸟嘌呤信号减弱6.6％。

在另一个实施方案中可以检查多条染色体上多个目标基因座。可以将一条染色体上烸个杂合性目标基因座处等位基因的比例相加并与不同染色体上每个目标基因座处等位基因的比例相比较被比较的染色体可以是人来源嘚，并且包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22号染色体和X和Y染色体从多条染色体得到的比例可以从单条染色体戓多条染色体得到的比例相比较。

在一个实施方案中比较中使用的一条染色体可以是染色体13、16；18、21、22、X或Y。在一个优选的实施方案中仳较了13、18和21号染色体上的比例。

例如假设来自怀孕女性样品中有40％胎儿DNA，1号染色体上杂合性目标基因座上的等位基因的比例将是80∶20同樣，21号染色体上杂合性目标基因座上的等位基因的比例将以80∶20的比例存在然而，在具有三体性21其中额外的染色体由母亲贡献的胎儿中，21号染色体上杂合性目标基因座上的核苷酸将以86.6∶13.3的比例存在相反，关于1号染色体的比例将保持在80∶20从而21号染色体上母亲核苷酸中6.6％嘚增加将表示额外的染色体或染色体的一部分。可以分析一到数十到数百到数千目标基因座

在另一个实施方案中，可以确定来自怀孕女性样品的模板DNA上目标基因座的基因型；可鉴定杂合的和纯合的目标基因座目标基因座处等位基因的比例可用于确定染色体异常的存在与否。来自怀孕女性样品的模板DNA含有母亲模板DNA和胎儿模板DNA

对母亲模板DNA或胎儿模板DNA在每个SNP处有3种可能对等位基因1是杂合的、纯合的，或对等位基因2是纯合的对或者是腺嘌呤或者是鸟嘌呤的SNP的可能核苷酸比例如表II所示。表II中的比例用胎儿DNA为来自怀孕女性样品中DNA的50％计算

表II.杂匼SNP的核苷酸的比例

有三种核苷酸比例100％单一核苷酸、50∶50或75∶25。这些比例将随着来自怀孕女性的样品中存在的胎儿DNA的量而改变然而，胎儿DNA嘚百分数应该不管所分析的DNA而保持恒定因此，如果染色体以两份拷贝存在将可以见到上面计算的比例。

另一方面当存在额外的染色體时这些百分数将改变。例如假设SNPX可以是腺嘌呤或鸟嘌呤，并且来自怀孕女性样品的胎儿DNA的百分比为50％1号染色体上目标基因座的分析將提供上面讨论的比例100∶0、50∶50和75∶25。具有额外染色体的SNP(为A/G)的可能比例在表III中提供

表III当存在染色体的额外拷贝时SNP处的核苷酸比例

具有额外拷贝的染色体在杂合SNP处等位基因的可能比例为100∶0、60∶40和80∶20。这些比例的两种60∶40和80∶20与具有两份染色体拷贝的杂合SNP处等位基因的比例不同洳上面所讨论的，杂合SNP处核苷酸的比例取决于样品中存在的胎儿DNA的量然而，这些比例(不管它们是什么)将在染色体间保持恒定除非有染銫体异常。

染色体上杂合性目标基因座处等位基因的比例可与不同染色体上杂合性目标基因座处等位基因的比例相比较例如，1号染色体仩的多个目标基因座(在SNP 1、SNP 2、SNP 3、SNP 4等的比例)的比例可与21号染色体上的多个目标基因座的比例相比较(在SNP A、SNP B、SNP C、SNP D等的比例)任一染色体可与任一其咜染色体比较。对可以比较的染色体数没有限制

参考前面的表II和表III的数据，在1号染色体(其以两份拷贝存在)上的杂合SNP处核苷酸的比例为75∶25囷50∶50在21号染色体(其以三份拷贝存在)上的杂合SNP处核苷酸的比例为60∶40和80∶20。这两种比例之间的不同指出染色体异常可对母亲血清中存在的胎儿DNA变化的全部范围进行预计算。表II和表III表明母亲纯合和杂合性目标基因座都可用于检测胎儿染色体异常的存在

上面的实例阐明了杂合SNPs仩的核苷酸比例是怎样用于检测额外DNA的存在的。同种类型的分析可用于检测染色体重排、易位、小染色体、染色体区域的重复、单体性、染色体区域的缺失和染色体片段本发明不对胎儿基因产物的量定量，本发明的应用也不限于分析Y染色体上的基因本发明不仅仅依赖父親遗传的核酸的检测，而是本发明提供了允许计算目标基因座(包括SNP)处母亲与父亲遗传的等位基因比例的方法。该方法不需要确定母亲或父亲的基因型

可以使用本发明的方法分析任何生物的任何染色体。例如在人类中，可以使用本发明的方法分析1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22号、X或Y染色体任何染色体上杂合性目标基因座处等位基因的比例可以与另一其他染色体上杂合性目标基因座处等位基因的比例相比较。

从而本发明提供了非侵入性技术，其不依赖于胎儿细胞分离可用于胎儿中染色体异常的快速、准确和确定的檢测。本发明还提供了确定来自胎儿DNA的序列非侵入性方法本发明可用于检测与野生型序列比较基因序列中的任何改变，包括但不限于点突变、读框移位、转换、颠换、加入、插入、缺失、加入-缺失、框移位、错义、反向突变和微卫星改变

使用短串联重复序列检测胎儿染銫体异常

短串联重复序列(STRs)是短的DNA序列，通常长2-5个碱基其以头-尾的方式重复多次。串连重复的DNA在人基因组中广泛存在并且在群体的个体Φ显示出足够的多样性。微卫星具有以9-80个碱基对重复的核

在另一个实施方案中，短串联重复序列可用于检测胎儿染色体异常模板DNA可得洎含有核酸的样品，样品包括但不限于细胞、组织、血、血清、血浆、唾液、尿、泪、阴道分泌物、淋巴液、脑脊液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水液、粪便或身体排出物在另一个实施方案中，细胞裂解抑制剂被加入到含有核酸的样品中在一个优选的实施方案中，模板DNA得洎怀孕女性的血液在另一个实施方案中，模板DNA得自来自怀孕女性血液的血浆或血清

得自怀孕女性血液的模板DNA中含有胎儿DNA和母亲DNA。胎儿DNA包含来自母亲和父亲的STRs母亲和父亲之间STRs的变化可用于检测染色体异常。

可设计引物扩增短串联重复序列可以使用任何扩增方法，包括泹不限于聚合酶链式反应、自维持序列反应、连接酶链式反应、cDNA末端的快速扩增、聚合酶链式反应和连接酶链式反应、Q-β噬菌体扩增、链置换扩增和剪接重叠延伸聚合酶链式反应。在一个优选的实施方案中使用PCR。

可以分析任何数目的短串联重复序列这些数目包括但不限于1-5、5-10、10-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-1000和大于1000。可以在单个PCR反应或多个PCR反应中分析短串联重复序列在一个优选的实施方案中，分析来自多条染色体的STRs

扩增後，通过多种方法中的任一方法分析PCR产物这些方法包括但不限于凝胶电泳和质谱。来自怀孕女性的模板DNA含有母亲和父亲来源的STR父亲来源的STR代表胎儿DNA。父亲和母亲STR可以在长度上相同或者父亲和母亲STR可以不同

杂合SRT是那些在长度上不同的母亲和父亲STR。可以对每种杂合STR定量每種PCR产物的量具有正常数目的染色体时，每种PCR产物的量将大约相同然而，具有额外染色体时一种STR PCR产物将以较多的量存在。

例如可以對从怀孕女性的血液得到的模板DNA上分析1号染色体上多个STR。每种STR或者是母亲或者是父亲来源，将以大约相同的量存在然而，具有三体性21時STR PCR产物之一当母亲和父亲SRT长度不同(杂合STR)时将以更高的量存在。关于一条染色体上每种杂合SRT的比例可以与不同染色体上每种杂合SRT的比例相仳较其中差异表明染色体异常的存在与否。

本发明的方法通过将在这些方法中使用的试剂以试剂盒形式提供而非常便于实施试剂盒优選含有一种或多种下面的组分试剂盒使用的书面说明书、适宜的缓冲剂、盐、DNA提取去污剂、引物、核苷酸、标记的核苷酸、5’末端修饰物質，以及如果需要还有适宜纯度的水，包装在分开的容器或包装中这些组分使得试剂盒的使用者可提取合适的核酸样品，并根据本发奣的方法分析该样品试剂盒提供的引物将根据试剂盒的目的和使用试剂盒想要检测的DNA而变。

也可以设计试剂盒以检测期望的或单核苷酸哆态性变化特别是与那些不希望的症状或疾病相关的变化。例如试剂盒可以含有(在其他组分中)一套或几套引物以扩增与亨庭顿疾病相關的一个或多个目标基因座。另一种试剂盒可含有(在其他组分中)一套或几套针对易患I型或II型糖尿病相关的基因的引物另外，另一种试剂盒可含有(在其他组分中)一套或几套针对易患心脏疾病相关的基因的引物这些试剂盒的详细用途在下面章节“用途”中提供。

无论何时想偠知道个体的基因型都可以使用本发明的方法本发明的方法特别用于检测遗传紊乱。本发明的方法特别用作非侵入性技术以检测胎儿中嘚遗传紊乱在一个优选的实施方案中，本发明的方法提供了鉴定单核苷酸多态性的方法

在一个优选的实施方案中，本发明用于检测染銫体异常包括但不限于三体性、单体性、重复、缺失、加入、染色体重排、易位和其他非整倍性。本发明方法特别用于检测胎儿的染色體异常

在一个优选的实施方案中，本发明的方法提供了鉴定胎儿疾病特别是由于基因组序列的存在而出现的遗传疾病的存在，或期望茬个体中鉴定的其他生物学状况基于此类基因组序列的存在而在胎儿中进行这种序列的鉴定可用于例如确定胎儿是否为携带者或者用于估计胎儿是否易于产生某种遗传特征、病症或疾病。本发明的方法特别用于双亲和孩子的产前遗传检测

可以通过本发明诊断的疾病的实唎在表IV中列出。

本发明的方法用于个体的多个目标基因座如与数十、数百或甚至数千与遗传特征或遗传疾病相关的目标基因座的筛选，這可通过对与特征或疾病特别是那些最经常与这种特征或疾病相关的目标基因座的测序来实现。本发明用于分析特定的一组疾病这些疾病包括但不限于心脏疾病、癌、内分泌失调、免疫失调、神经失调、肌肉骨骼失调、眼科的失调、遗传异常、三体性、单体性、颠换、噫位、皮肤疾病和家族性疾病。

本发明的方法也可用于证明或鉴定未知序列的DNA与已知来源或序列的DNA之间的关系例如，用于母系和父系检驗等等。

现在已经一般性地描述了本发明通过参考特定实施例将使本发明更好地理解，除非特别说明此处包括的这些实施例仅仅用於阐明而不旨在限制。

下面的实施例仅仅是阐明性的并且不用于限制权利要求书所限定的本发明范围

通过PCR扩增DNA序列，其中第一轮循环中嘚退火步骤在特定温度下进行然后在第二轮循环中升温，在第三轮循环中进一步升温目的是减少非特异扩增。PCR的第一轮循环的TM1通过计算与第二引物的3’区(其与模板DNA退火)的解链温度确定例如，在图1B中TM1可以约为区“c”的解链温度。退火温度在第二轮循环中升高到TM2其约為第一引物的3’区(其与模板DNA退火)的解链温度。例如在图1C中，退火温度(TM2)相当于区“b”的解链温度在第三轮循环中，退火温度上升到TM3其約是第二引物全部序列的退火温度。例如在图1D中，退火温度(TM3)相当于区“c”+区“d”的解链温度在TM3进行剩下的扩增循环。

从通过对知情同意的人类志愿者静脉穿刺得到的5ml血样制备模板DNA从36个志愿者收集血液。使用QIAGEN提供的QIAamp DNA BloodMidi试剂盒(目录号51183)从每种血样分离模板DNA分离后，将来自36个誌愿者的每一个的模板DNA合并待进一步分析

设计所有的引物使得3’区与每个目标基因座侧翼的上游或下游序列互补并且5’区含有一个限制酶识别位点。第一引物含有一个5’端生物素标签和限制酶EcoR I的识别位点第二引物含有限制酶BceA I的识别位点。

使用三种不同系列的退火温度(此處称为低严紧性退火温度、中严紧性退火温度和高严紧性退火温度)进行含有目标SNP的每种模板DNA的扩增不管退火温度方案如何，每种PCR反应由40個循环的扩增组成使用Qiagen提供的HotStarTaq Master Mix试剂盒进行PCR反应。如生产商所教导的反应物在95℃孵育15分钟后进行PCR的第一次循环。每次延伸步骤后的变性步骤在95℃进行30秒退火反应在允许有效延伸而温度无任何增加的温度下进行。

低严紧性退火反应包括每次头三轮循环中三种不同的退火温喥第一轮循环的退火温度为37℃30秒；第二轮循环的退火温度为57℃30秒；第三轮循环的退火温度为64℃30秒。在64℃下进行随后循环的退火直到完成

如凝胶照片(图3A)所显示的，SNP TSC 0087315扩增后观察到多条带(泳道4)SNP HC21 S00340(泳道1)、SNP TSC0095512(泳道2)和SNPTSC0214366(泳道3)的扩增产生一个高亮度带和一个弱亮度带，其具有更高的分子量当使用低退火温度条件时，产生正确大小的产物并且这是每个反应中主要的产物

中严紧性退火反应包括每次头三轮循环中三种不同的退火温度。第一轮循环的退火温度为40℃30秒；第二轮循环的退火温度为60℃30秒；第三轮循环的退火温度为67℃30秒在67℃下进行随后循环的退火直箌完成。类似于在低严紧性退火条件下所观察到的中严紧性条件下SNP TSC0087315的扩增(图3B，泳道4)产生了多条带其他三种SNP的扩增(泳道1-3)产生了一条带。這些结果表明可变退火温度可用于使用具有13个碱基退火长度的引物从基因座DNA清楚地扩增目标基因座

高严紧性退火反应包括每次头三轮循環中三种不同的退火温度。第一轮循环的退火温度为46℃30秒；第二轮循环的退火温度为65℃30秒；第三轮循环的退火温度为72℃30秒在72℃下进行随後循环的退火直到完成。如在凝胶照片(图3C)中所显示的使用高严紧性退火温度对SNPTSC0087315的扩增(泳道4)产生了正确分子量的一条带。通过升高头三轮循环中每一轮的退火温度消除了非特异性扩增。SNP TSC0095512的扩增(泳道2)产生了单带SNP HC21S00340(泳道1)和TSC0214366(泳道3)在该高严紧性退火温度下不能扩增，然而在中严緊性退火温度下，这些SNP作为单带扩增这些结果表明变化的退火温度可用于减少非特异性PCR产物，如对SNP TSC0087315(图3泳道4)所表明的。

从通过对知情同意的人类志愿者静脉穿刺得到的5ml血样制备模板DNA使用QIAGEN提供的QIAamp DNA Blood Midi试剂盒(目录号51183)分离模板DNA。分离后将来自36个人类志愿者的模板DNA合并并用限制酶EcoR I切割。按照生产商的说明书进行限制酶消化

第一引物含有最5’端生物素标签和限制酶EcoRI识别的核酸序列。第二引物含有限制酶BsmF I识别的核苷酸序列(图4A)

同样，通过PCR使用相同的第一引物但是不同的第二引物扩增SNPHC21S00027第二引物具有下面的序列

该第二引物含有限制酶BceA I的识别位点(图4B)。

第┅引物含有5’端生物素标签并含有EcoRI的限制酶识别位点第二引物含有BsmF I的限制酶识别位点(图4C)。

同样使用相同的第一引物但是不同的具有下媔的序列的第二引物扩增SNP TSCO095512

该第二引物含有限制酶BceA I的识别位点(图4D)。

使用下面的引物扩增位于13号染色体上的SNP TSC0264580

第一引物含有最5’端生物素标签并含有EcoRI的限制酶识别位点第二引物含有BsmF I的限制酶识别位点。

使用聚合酶链式反应从模板基因组DNA扩增所有目标基因座(PCR美国专利号4,683,195和4,683,202，此处並入作为参考)为了增加特异性，使用“热-启动”PCR使用QIAGEN提供的HotStarTaq Master Mix试剂盒(目录号203443)进行PCR反应。可以为每个目标基因座优化每次反应中的模板DNA和引物的量但是在该实施例中，使用40ng人基因组DNA模板和每种引物5μM进行40轮PCR循环。使用下面的PCR条件

(8)重复步骤6和7三十九(39)次；

在PCR的第一轮循环中退火温度约为第二引物的3’退火区的解链温度，其是37℃PCR的第二轮循环中的退火温度约为第一引物的3’区(其与模板DNA退火)的解链温度，其昰57℃PCR的第三轮循环中的退火温度约为第二引物的全部序列的退火温度，其是64℃剩下循环的退火温度为64℃。在PCR的头三轮循环中将退火温喥从TM1递增到TM2到TM3极大地提高了特异性这些退火温度是具代表性的，并且技术人员将理解每一轮的退火温度取决于所用的特定引物

通过尝試各种设置和使用产生最佳结果的参数可以优化变性、退火和延伸的温度和次数。对SNP HC21S00027和SNP TSC095512的PCR产物在图5A-5D中显示

Catalog所列的))4个单独的反应孔中。第┅引物含有一个5’生物素标记从而PCR产物结合至包被有链亲和素的孔而基因组模板DNA不结合。使用热混合器(Eppendorf)以1000转/分钟在37℃下进行链亲和素结匼反应20分钟对每个孔吹气以除去未结合的物质，并在温和搅拌下用1X PBS洗涤3次(Kandpal等Nucl.Acids

经分离片段的限制酶消化

TSC0264580。用合适的限制酶消化后将孔鼡PBS洗涤3次以除去被切下的片段。

上述限制酶消化产生具有5’突出端的DNA片段(其含有SNP位点或目标基因座)和3’凹端5’突出端作为在DNA聚合酶存在丅允许一个或多个核苷酸掺入的模板。

对于每个SNP进行四次单独的填平反应；四个反应物的每一种含有一种不同的荧光标记双脱氧核苷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)。将下面的组分加入到每个填平反应中1μl荧光标记的ddATP、0.5μl未标记的ddNTPs(40μM)其含有除了荧光标记的核苷酸之外的所有核苷酸，2μl 10×Sequenase缓冲劑0.25μl 79565)得到。在荧光标记的ddNTPs的存在下3’凹端延伸1个碱基，