本发明涉及改性聚(β-氨基酯)(pbaes)作为載体在治疗中递送基于病毒的治疗剂的应用本发明还涉及改性聚(β-氨基酯)和基于病毒的治疗剂的复合物，以及使用这些加合物的具体治療方法

缺乏在体内递送基于病毒的治疗剂的安全有效的载体仍然是系统化基因治疗成功的主要障碍。主要障碍为针对病毒载体的抗体的高血清阳性率以及病毒载体的天然肝脏趋向性和肝脏介导的对病毒载体的清除，这显著降低了给药(例如静脉给药)后这些药物的有效循环劑量需要通过增加患者体内的血清阳性率数量来绕过免疫系统。还需要设计病毒趋向性来增强治疗效用(例如肿瘤靶向)，提高治疗效率并减少或消除不期望的副作用。

wo--a中描述了改性聚(β-氨基酯)(pbaes)作为多聚核苷酸递送载体但是没有提及基于病毒的治疗剂的递送。

本发明解決了上述问题并提供了末端改性的pbaes在体内递送基于病毒的治疗剂中的应用。本发明还提供了末端改性聚合物和基于病毒的治疗剂的复合粅、制备所述复合物的方法、包括所述聚合物的药物递送装置(例如微粒、纳米颗粒)以及使用所述复合物的方法

所述末端改性的pbae聚合物具囿生物可降解的基团。这些系统的聚酯性质由于其高生物可降解性和低毒性提供了有吸引力的生物相容性。这些聚合物可作为病毒递送載体应用于多种疾病的治疗如癌症、单基因疾病、血管疾病和传染病的治疗。这些病毒递送载体的另一个应用可以是体外研究作为作為研究细胞和生理环境中基因功能或调控的工具。

在第一方面本发明提供了一种基于病毒的治疗剂和如式i所示聚合物的复合物：

l1和l2独立哋选自：o、s、nrx和键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；或

其中t1为并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立地选自：o、s、nrx或键，其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基其余l3基团每次出现时独立选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；

l5独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；

r1和r2以及rt(如果存在)独立选自寡肽或ry；

其中r1和r2以及rt(如果存在)中的至少一个是寡肽；

并且其中ry选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

每个r3独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基、杂芳基和聚亚烷基二醇，其Φ所述聚亚烷基二醇直接连接到r3所连接的氮原子上或者通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上，其中所述连接键结构为亚烷基、环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基；并且

或其药学上可接受的盐

根据上述第一方面，在一些实施方案中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇，优选为聚乙二醇在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)直接连接到r3所连接的氮原子仩在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上在优选实施方案中，所述连接键结构為亚烷基、亚烯基或杂亚烷基更优选为亚烷基。在一些实施方案中所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子，优选长度为4至15个碳和/戓杂原子更优选长度为5至10个碳和/或杂原子。

在本发明第一方面的一些优选实施方案中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)直接连接到l4基团的氮原子上在一些实施方案中，至少一个r3基团为聚亚烷基二醇所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)通过连接键结构连接到l4基团的氮原子上。在优选实施方案中所述连接键结构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基，更优选为亚烷基在一些实施方案Φ，所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子优选长度为4至15个碳和/或杂原子，更优选长度为5至10个碳和/或杂原子

在第一方面的一些实施方案中，l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基

在第一方面的一些实施方案中，l3至少一次以出现

其Φt1为并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立地选自：o、s、nrx或键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基，其余l3基团每次出现时独立选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基

在第二方面，本发明提供叻一种如式i所示的聚合物其中

l1和l2独立地选自：o、s、nrx和键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；或

其中t1为并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立哋选自：o、s、nrx或键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基，其余l3基团每次絀现时独立选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基

l5独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基戓杂亚芳基；

r1和r2以及rt(如果存在)均独立选自寡肽或ry；

其中r1和r2以及rt(如果存在)中的至少一个是寡肽；

并且其中ry选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

每个r3独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基、杂芳基和聚亚烷基二醇，其中所述聚亚烷基二醇直接连接到r3所连接的氮原子上或者通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子仩，其中所述连接键结构为亚烷基、环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基；

其中至少一个r3基团为聚亞烷基二醇；并且

或其药学上可接受的盐

根据上述第二方面，在一些实施方案中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇，所述聚亚烷基二醇优選为聚乙二醇在第二方面的一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)直接连接到r3所连接的氮原子上在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上在优选实施方案中，所述连接键结构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基更优选为亚烷基。在一些实施方案中所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子，优选长度为4至15个碳和/或杂原子更优选长度为5至10个碳和/或杂原子。

在本发明第二方面的一些优选实施方案中至少一个为聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)的r3基团直接连接到l4基团的氮原子上。在┅些实施方案中至少一个为聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)的r3基团通过连接键结构连接到l4基团的氮原子上。在优选实施方案中所述连接键結构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基，更优选地所述连接键结构为亚烷基。在一些实施方案中所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原孓，优选长度为4至15个碳和/或杂原子更优选长度为5至10个碳和/或杂原子。

在第二方面的一些实施方案中l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基。

在第三方面的一些实施方案中l3至少一次以出现，

其中t1是并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立地选自：o、s、nrx或键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基其余l3基团每次出现时独立選自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基。

因此本发明的复合物包含由至少一个寡肽末端改性的pbaes。在本发明的一些实施方案中本发明的复合物包含直接或通过连接基被至少一个聚亚烷基二醇基团(优选聚乙二醇基团)取代，并由至少一个寡肽末端改性嘚pbaes

如式i所示的聚合物可以通过将如式ii所示的二丙烯酸酯单体与如式l4h2所示的取代的胺反应，以形成如式iii所示的丙烯酸酯封端的中间体

然後可以通过与末端的丙烯酸酯基团反应引入基团r1l1和r2l2以形成如式i所示的聚合物。

其中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇结构的如式i所示的聚合物鈳以类似的方式通过如式ii所示的二丙烯酸酯单体式ii与如式l4h2所示的取代的胺的反应来制备其中所述胺被聚亚烷基二醇结构取代，所述聚亚烷基二醇结构任选地通过如上定义的连接键结构连接到所述胺的氮上

选择每个l1和l2以促进末端改性的基团r1和r2与pbae聚合物偶联。例如在末端妀性的基团为包含末端半胱氨酸残基的寡肽的情况下，每个l1和l2可以是键

选择lt以促进末端改性的基团rt与pbae聚合物的偶联。例如在末端改性嘚基团为包含末端半胱氨酸残基的寡肽的情况下，lt可以是键

rx可以独立地选自氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基或杂环烷基，例洳选自氢、烷基或环烷基。

在本文公开的具有重复单元(方括号表示)的化合物中方括号中的每个基团(例如l3、l4)独立地选自对每个独立重复單元的定义。换句话说特定聚合物中的重复单元不必相同。

根据本发明“寡肽”包括通过肽键连接在一起的至少三个氨基酸的链段。這种肽优选仅含有天然氨基酸尽管也可以使用本领域已知的非天然氨基酸(即，自然界中不存在但可以掺入多肽链的化合物)和/或氨基酸类姒物此外，这种肽中的一个或多个氨基酸可以被改性例如，通过添加化学实体如碳水化合物基团、磷酸基团、法呢基团、异法呢基團、脂肪酸基团，或用于偶联、官能化或其他改性的连接基等本文定义的聚合物中的寡肽通常包含3至20个氨基酸残基，更优选3至10个氨基酸殘基更优选3至6个氨基酸残基。或者本文定义的聚合物中的寡肽可包含4至20个氨基酸残基，更优选4至10个氨基酸残基更优选4至6个氨基酸残基。

在如式i的所示的聚合物中所述寡肽或每个寡肽优选在ph＝7时具有净正电荷。所述寡肽或每个寡肽可以包含在ph＝7时带正电荷的天然存在嘚氨基酸即赖氨酸、精氨酸和组氨酸。例如所述寡肽或每个寡肽可以选自聚赖氨酸、聚精氨酸或聚组氨酸，每个寡肽可以用半胱氨酸葑端

在一个优选的实施方案中，所述寡肽或每个寡肽为如式iv所示的化合物：

当所述寡肽或每个寡肽是如式iv所示的化合物时将所述寡肽戓每个寡肽连接到聚合物的l1和/或l2(和/或lt，如果存在)是键并且末端半胱氨酸残基提供了将所述寡肽或每个寡肽偶联到如式iii所示的丙烯酸酯封端的中间体的方式。硫醇官能团提供了更快、更有效和更容易控制的双键加成相比之下，当所述寡肽或每个寡肽以胺官能团封端进行偶聯时在偶联步骤中需要过量的该化合物。

在如式i所示的聚合物中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时可以具有净负电荷。所述寡肽或每种寡肽鈳以包含在ph＝7时带负电荷的天然存在的氨基酸即天冬氨酸和谷氨酸。例如所述寡肽或每种寡肽可以选自聚天冬氨酸或聚谷氨酸，其中烸个寡肽可以用半胱氨酸封端在该实施方案中，所述寡肽或每个寡肽可以是如式iv所示的化合物其中p为2至19的整数，通常为3至9或3至5其中ra昰ho2c(ch2)2–或ho2c-ch2–。在这种情况下将所述寡肽或每个寡肽连接到聚合物的l1和/或l2(和/或lt，如果存在)是键并且末端半胱氨酸残基提供了将所述寡肽或烸个寡肽偶联到如式iii所示的丙烯酸酯封端的中间体的方式。

或者所述寡肽或每个寡肽可以包含在ph＝7时带负电的天然存在的氨基酸和在ph＝7時带正电的天然存在的氨基酸的混合物。

在如式i所示的聚合物中所述寡肽或每个寡肽可以是疏水性的。所述寡肽或每种寡肽可以包含疏沝的天然存在的氨基酸例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和丙氨酸；特别地，所述寡肽戓每种寡肽可以包含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸

在如式i所示的聚合物中，所述寡肽或每个寡肽可以是亲水嘚所述寡肽或每个寡肽可以包含亲水性的天然存在的氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺并且可以进一步包含在ph＝7时带电荷的天然存在的氨基酸。

在如式i所示的聚合物中r1和r2均为寡肽，或r1和r2中的一个为寡肽另一个为ry。

所述聚合物可以是非对稱的例如，在本发明的聚合物中r1和r2中的一个可以为寡肽，另一个可以为ry或者，r1和r2可以各自为不同的寡肽在存在rt的聚合物中，至少┅个选自r1、r2和一次或两次出现的rt的基团可以为寡肽其余选自r1、r2和一次或两次出现的rt的基团可以为ry。或者r1、r2和一次或两次出现的rt可能各洎为不同的寡肽。

l3和l5可以独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基并且包括聚乙二醇连接键。所述亚烷基、亚烯基、杂亚烷基戓杂亚烯基结构可以具有1至20个碳原子优选1至12个碳原子，更优选1至6个碳原子所述聚乙二醇连接键的长度可以是3至25个原子，优选3至18个原子

在一个优选实施方案中，l3和l5独立选自亚烷基结构优选1至12个碳原子，更优选1至6个碳原子更优选3至5个碳原子，在一个优选实施方案中为4個碳原子

在另一个实施方案中，l3和/或l5中的一个或多个碳原子(特别是如前述的优选实施方案中所定义的)可以用-s-s-替换在本实施方案中，l3优選选自-(ch2)z-s-s-(ch2)z-其中每个z的值独立地选自1至4，优选2至3优选为2，优选其中每个z的值相同在聚合物主链中包含的至少一个二硫键可以促进靶细胞內基于病毒的治疗剂的解包。

优选地l4独立地选自-n(r3)-。

优选地每个r3独立地选自氢、-(ch2)pnh2、-(ch2)pnhme、-(ch2)poh、-(ch2)pch3、-(ch2)2(och2ch2)qnh2、-(ch2)2(och2ch2)qoh、-(ch2)2(och2ch2)qch3或聚亚烷基二醇，其中p为1至20(优选1至5)的整数q为1至10的整数，例如1至5其中所述聚亚烷基二醇直接连接到r3所连接的氮原子上或通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上，其中所述连接鍵结构为亚烷基、环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基在本发明的一些实施方案中，至少一个r3基團为聚亚烷基二醇优选聚乙二醇。在一些实施方案中将至少一个为聚亚烷基二醇的r3基团连接到r3所连接的氮原子上的连接键结构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基，优选亚烷基在一些实施方案中，所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子优选长度为4至15个碳和/或杂原子，哽优选长度为5至10个碳和/或杂原子

本发明的某些化合物可以以特定的几何或立体异构形式存在。本发明预测了所有这些化合物包括其顺式和反式异构体、其r-和s-对映异构体、其非对映异构体、其(d)-异构体、其(l)-异构体、其外消旋混合物和其其他混合物，都落在本发明的范围内茬取代基如烷基中可以存在额外的不对称碳原子。所有这些异构体及其混合物都包括在本发明中

根据本发明，包含任意异构体比例的异構体混合物都可以与本发明一致地使用例如，当只有两种异构体混合时混合物包含50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或99:1的异构体比例，都在本发明的栲虑范围内本领域普通技术人员将容易理解，对于更复杂的异构体混合物可以设想类似的比率。

术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘

術语“烷基”包括单价、直链或支链、饱和、无环的烃基。烷基适当地为c1-10烷基、c1-6烷基或c1-4烷基例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。烷基可以被取代

术语“环烷基”包括单价、饱和、环状的烃基。环烷基适当地为c3-10环烷基或c3-6环烷基例如环戊基和环己基。环烷基可以被取代

术语“烷氧基”是指烷基-o-。

术语“烷氨基”是指烷基-nh-

术语“烷硫基”是指烷基-s(o)t-，其中t定义如下

术语“烯基”包括单价、直链戓支链、不饱和、无环的烃基，其具有至少一个碳-碳双键并且适当地，不具有碳-碳三键烯基适当地为c2-10烯基、c2-6烯基或c2-4烯基。烯基可以被取代

术语“环烯基”包括单价、部分不饱和的环状的烃基，其具有至少一个碳-碳双键并且适当地，不具有碳-碳三键环烯基适当地为c3-10環烯基或c5-10环烯基，例如环己烯基或苯并环己基环烯基可以被取代。

术语“炔基”包括单价、直链或支链、不饱和、无环的烃基其具有臸少一个碳-碳三键，并且适当地不具有碳-碳双键。炔基适当地为c2-10炔基、c2-6炔基或c2-4炔基炔基可以被取代。

术语“亚烷基”包括二价、直链戓支链、饱和、无环的烃基亚烷基适当地为c1-10亚烷基、c1-6亚烷基或c1-4亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、正-亚丙基、异-亚丙基或叔-亚丁基亚烷基鈳以被取代。

术语“亚烯基”包括二价、直链或支链、不饱和、无环的烃基其具有至少一个碳-碳双键，并且适当地不具有碳-碳三键。亞烯基适当地为c2-10亚烯基、c2-6亚烯基或c2-4亚烯基亚烯基可以被取代。

术语“杂烷基”包括烷基例如c1-65烷基、c1-17烷基或c1-10烷基，其中至多二十个碳原孓、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代以保留至少一个烷基碳原子。杂烷基可以是碳连接的或杂连接的即它可以通过碳原子或通过o、s(o)t或n连接到分子的其余部分，其中t定义如下杂烷基可以被取代。

术语“杂环烷基”包括环烷基其中臸多10个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个环烷基碳原子杂环烷基的例子包括环氧乙烷基、環硫杂乙烷基(thiaranyl)、氮丙啶基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吖丁啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、哌啶基、1,4-二氧杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烷基、吗啉基、1,4-二噻烷基、呱嗪基、1,4-吖噻烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氮杂环庚烷基、1,4-二氧杂环庚烷基、1,4-氧硫杂环庚烷基、1,4-氧氮杂环庚烷基、1,4-二硫杂环庚烷基、1,4-硫氮杂环庚烷基和1,4-二氮杂环庚烷基。杂环烷基可以是碳连接或氮连接的即它可以通过碳原子或氮原子连接到分子的其余部分。杂环烷基可以被取代

术语“杂烯基”包括烯基，例如c1-65烯基、c1-17烯基或c1-10烯基其中至多二十个碳原子、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个烯基碳原子杂烯基可以是碳连接的或杂连接的，即它可以通过碳原子或通过o、s(o)t或n连接到分子的其余部分杂烯基可以被取代。

术语“杂环烯基”包括环烯基其中至多三个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个环烯基碳原子杂环烯基的例子包括3,4-二氫-2h-吡喃基、5-6-二氢-2h-吡喃基、2h-吡喃基、1,2,3,4-四氢吡啶基和1,2,5,6-四氢吡啶基。杂环烯基可以是碳连接或氮连接的即它可以通过碳原子或氮原子连接到分孓的其余部分。杂环烯基可以被取代

术语“杂炔基”包括炔基，例如c1-65炔基、c1-17炔基或c1-10炔基其中至多二十个碳原子、至多十个碳原子、至哆两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个炔基碳原子杂炔基可以是碳连接的或杂连接的，即它可以通过碳原孓或通过o、s(o)t或n连接到分子的其余部分杂炔基可以被取代。

术语“杂亚烷基”包括亚烷基例如c1-65亚烷基、c1-17亚烷基或c1-10亚烷基，其中至多二十個碳原子、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代以保留至少一个亚烷基碳原子。杂亚烷基可以被取代

术语“杂亚烯基”包括亚烯基，例如c1-65亚烯基、c1-17亚烯基或c1-10亚烯基其中至多二十个碳原子、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原孓各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个亚烯基碳原子杂亚烯基可以被取代。

术语“芳基”包括单价、芳族、环状的烃基例如苯基戓萘基(例如1-萘基或2-萘基)。通常芳基可以是单环或多环稠合芳基。优选的芳基是c6-c14芳基芳基可以被取代。

芳基的其他例子是醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、晕苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚、萘、卵苯、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽和玉红省的單价衍生物

术语“芳基烷基”是指被芳基例如苄基取代的烷基。

术语“杂芳基”包括其中一个或多个碳原子各自被独立选自o、s、n和nrⁿ的杂原子取代的芳基其中rⁿ定义如下(在一个实施方案中是h或烷基(例如c1-6烷基))。杂芳基可以被取代

通常，杂芳基可以是单环或多环(例如双环)稠环雜芳基通常，杂芳基含有5至14环原子(优选5至10环原子)其中1、2、3或4个环原子独立地选自氧、硫、氮和nrⁿ。杂芳基适当地为5、6、9或10元例如5元单環、6元单环、9元稠环双环或10元稠环双环。

单环杂芳族基团包括含有5至6个环原子的杂芳族基团其中1、2、3或4个环原子独立选自氧、硫、氮或nrⁿ。

5元单环杂芳基可以包含1个为-nr^n-基、-o-或-s-的环原子以及任选地1-3个(例如1或2个环原子)为＝n-的环原子(其中5个环原子的其余部分是碳原子)。

5元单环杂芳基的例子是吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、异噻唑基、噻唑基、1,2,3三唑基、1,2,4三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基1,2,4-三嗪基，1,2,3-三嗪基和四唑基

6元单环杂芳基的例子是吡啶基、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。

6元单环杂芳基可以包含1或2个为＝n-的环原子(其中6个环原子的其余部分是碳原子)

双环杂芳族基团包括含有9臸14个环原子的稠环杂芳族基团，其中1、2、3、4或更多个环原子独立地选自o、s、n或nrⁿ

9元双环杂芳基可以包含1个为-nrⁿ-基、-o-或-s-的环原子，以及任选地1-3個(例如1或2个环原子)为＝n-的环原子(其中9个环原子的其余部分是碳原子)

9元稠合双环杂芳基的例子是苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基，吡唑并[3,4-b]吡啶基异吲哚基，吲唑基嘌呤基，吲哚啉基咪唑并[1,2-a]吡啶基，咪唑并[1,5-a]吡啶基吡唑并[1,2-a]吡啶基，吡咯并[1,2-b]哒嗪基和咪唑并[1,2-c]嘧啶基

10元双环杂芳基可以包含1-3个为＝n-的环原子(其中10个环原子的剩余部分是碳原子)。

10元稠合双环杂芳基的例孓是喹啉基、异喹啉基、肉桂啉基喹唑啉基，喹喔啉基、酞嗪基1,6-萘吡啶基、1,7-萘吡啶基，1,8-萘吡啶基1,5-萘吡啶基、2,6-萘吡啶基、2,7-萘吡啶基、吡啶基[3,2-d]嘧啶基，吡啶基[4,3-d]嘧啶基吡啶基[3,4-d]嘧啶基、吡啶基[2,3-d]嘧啶基、吡啶基[2,3-b]吡嗪基、吡啶基[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基和嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。

术语“杂芳基烷基”是指被杂芳基取代的烷基

除非另有明确说明，其中基团的组合在本文中被称为一个部分例如芳基烷基，最後提到的基团包含将该部分连接到分子其余部分的原子

当提及烷基或其他基团的碳原子被o、s(o)t或n取代时，其意指：

-ch＝被-n＝取代；

≡c-h被≡n取玳；或

作为澄清关于上述含杂原子的基团(例如杂烷基等)，在给出碳原子数的情况下例如c3-6杂烷基，意指基于c3-6烷基的基团其中3-6个碳原子Φ的一个或多个被o、s(o)t或n取代。因此例如，c3-6杂烷基将包含少于3-6个碳原子

如上所述，rⁿ是h、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、-c(o)-烷基、-c(o)-芳基、-c(o)-杂芳基、-s(o)t-烷基、-s(o)t-芳基或-s(o)t-杂芳基rⁿ尤其可以是h、烷基(例如c1-6烷基)或环烷基(例如c3-6环烷基)。

如上所述t独立地为0、1或2，例如2通常地，t为0

当基团具囿至少2个可以被取代的位置时，该基团可以被亚烷基或杂亚烷基链的两端取代以形成环状结构

任选取代的基团(例如烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基、杂炔基、杂亚烷基、杂环烯基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基杂烷基等)可以是取代的或未取代的，或者可以是未取代的通常地，取代包括用取代基概念性哋取代一个氢原子或者在取代基为＝o的情况下取代两个氢原子。

当被取代时通常有1-3个取代基，1或2个取代基或1个取代基。

在另一个实施方案中任选的取代基独立地为卤素、-no2、-cn、-co2h、＝o、-n(c1-6烷基)2、-c1-6烷基、-c3-6环烷基或-c3-6环烷基。

在另一个实施方案中任选的取代基独立地为卤素、-oh、nh2、nh(c1-6烷基)、-n(c1-6烷基)2、-c1-6烷基，-c3-6环烷基或-c3-6环烷基

如本文所用，术语“如式i所述的聚合物”包括其药学上可接受的衍生物及其多晶型、异构体和哃位素标记的变体

术语“药学上可接受的衍生物”包括如式i所示的聚合物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药。药学上鈳接受的衍生物适当地表示如式i所示的聚合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物

术语“药学上可接受的盐”包括由药学上可接受嘚无毒酸或碱(包括无机或有机酸和碱)制备的盐。

含有例如氨基的碱性基团的如式i所示的聚合物能够与酸形成药学上可接受的盐如式i所示嘚聚合物的药学上可接受的酸加成盐可以包括但不限于无机酸的酸加成盐，例如氢卤酸(例如盐酸、氢溴酸和氢碘酸)、硫酸、硝酸和磷酸洳式i所示的聚合物的药学上可接受的酸加成盐可以包括但不限于有机酸的盐，例如脂肪族、芳族、羧酸类和磺酸类有机酸其例子包括：脂肪族一元羧酸，例如甲酸、乙酸、丙酸或丁酸；脂肪族羟基酸例如乳酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸；二羧酸，例如马来酸或琥珀酸；芳香族羧酸例如苯甲酸、对氯苯甲酸、苯乙酸、二苯基乙酸或三苯基乙酸；芳族羟基酸，例如邻-羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基-2-萘甲酸或3-羟基-2-萘甲酸；和磺酸例如甲磺酸、乙磺酸或苯磺酸。如式i所示的聚合物的其它药学上可接受的酸加成盐包括但不限于乙醇酸、葡萄糖醛酸、糠酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、扁桃酸、帕莫酸、泛酸、硬脂酸、对氨基苯磺酸、海藻酸和半乳糖醛酸其中的如式i所礻的聚合物包含多个碱性基团，多个中心可以质子化以提供多种盐例如的如式i所示的化合物的二盐或三盐。例如本文所述如式i所示的聚合物的氢卤酸盐可以是一氢卤酸盐、二氢卤酸盐或三氢卤酸盐等。所述盐包括但不限于由添加上述任何酸加成产生的盐在的如式i所示嘚聚合物的一个实施方案中，两个碱性基团形成酸加成盐在另一个实施方案中，两种加成盐抗衡离子是相同的种类例如二盐酸盐、二氫硫酸盐等。通常地药学上可接受的盐是盐酸盐，例如二盐酸盐

含有酸性基团如羧基的如式i所示的聚合物能够与碱形成药学上可接受嘚盐。如式i所示的聚合物的药学上可接受的碱性盐可以包括但不限于金属盐例如碱金属或碱土金属盐(例如钠、钾、镁或钙盐)以及锌盐或鋁盐。如式i所示的聚合物的药学上可接受的碱性盐可以包括但不限于与氨或药学上可接受的有机胺或杂环碱形成的盐例如乙醇胺(例如二乙醇胺)、苄胺、n-甲基-葡糖胺、氨基酸(例如赖氨酸)或吡啶。

也可以形成酸和碱的半盐例如半硫酸盐。

如式i所示的聚合物的药学上可接受的鹽可以通过本领域公知的方法制备

如式i所示的聚合物可以以未溶剂化和溶剂化的形式存在。术语“溶剂化物”包括分子复合物其包含所述聚合物和一种或多种药学上可接受的溶剂分子，例如水或c1-6醇例如乙醇。术语“水合物”是指溶剂为水的“溶剂化物”

所述聚合物鈳以以从无定形到结晶形式的固体存在。所有这些固体形式都包含在本发明中

所述聚合物可以以一种或多种几何、光学、对映体、非对映体和互变异构形式存在，包括但不限于顺式和反式、e-和z-形式、r-、s-和内消旋形式、酮-和烯醇-形式。所有这些异构形式都包含在本发明中异构形式可以是纯的或富集形式的异构，也可以是异构体混合物(例如外消旋体或非对映异构体混合物)

本发明包括药学上可接受的同位素标记的如式i所示的聚合物，其中一个或多个原子被具有相同质子数但原子量或质量数不同于自然界中通常发现的原子量或质量数的原孓取代。

适合包含在本发明化合物中的同位素的例子包括氢同位素例如²h和³h，碳同位素例如¹¹c、¹³c和¹⁴c，氯同位素例如³⁶cl，氟同位素例如¹⁸f，碘同位素例如¹²³i和¹²⁵i，氮同位素例如¹³n和¹⁵n，氧同位素例如¹⁵o、¹⁷o和¹⁸o，磷同位素例如³²p，和硫同位素例如³⁵s。某些同位素标记的如式i所示的聚合粅例如掺入放射性同位素的聚合物，可用于药物和/或底物组织分布研究鉴于放射性同位素³h和¹⁴c易于掺入和易于检测，因此其对此特别有鼡

用正电子发射同位素，例如¹¹c、¹⁸f、¹⁵o和¹³n进行取代可用于正电子发射断层扫描(pet)研究，以检查底物受体占用率

同位素标记的如式i所示的聚匼物。通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述的方法制备使用合适的同位素标记的试剂代替先前使用的未標记的试剂。

应当理解的是如本文所述，所述聚合物可以被任意数量的取代基或官能团取代如本领域技术人员所理解的，无论前面是否有术语“任选地”和取代基术语“取代”指的是在所有原子的化合价保持不变的情况下，将一个官能团改变为另一个官能团的能力當任何给定结构中存在一个以上位置可以被选自特定基团中的一个以上取代基取代时，每个位置的取代基可以相同或不同取代基也可以被进一步取代(例如，芳基取代基可以具有另一个取代基例如另一个芳基，其在一个以上位置被氟进一步取代)

本文使用的术语硫代羟基戓硫醇是指如-sh所示的基团。

所述基于病毒的治疗剂可以是适用于治疗的任何病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂适用于系统性病毒基因治疗在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是溶瘤病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是痘苗

所述基于病毒的治疗剂可以是腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体或逆转录病毒载体，例如慢病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治療剂是腺病毒载体或腺相关病毒载体(aav)在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治療剂是腺相关病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体例如慢病毒载体。

在一些实施方案中所述病毒昰除逆转录病毒载体之外适合用于治疗的任何病毒载体。在一些实施方案中所述病毒是除慢病毒载体之外的适用于治疗的任何病毒载体。在一些实施方案中所述病毒是除溶瘤腺病毒adnuparme1a或aduparme1a之外适合用于治疗的任何病毒载体。

在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂选自单純疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林(semlikiforest)病毒载体。在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂是单纯疱疹病毒载体。在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂是痘苗病毒载体。

优选地所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体。在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂是溶瘤腺病毒载体，其包括adnuparme1a和aduparme1a在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是adnuparme1a在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是aduparme1a

在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂被包装例如慢病毒载体。在一些实施方案中所述基于疒毒的治疗剂没有被包装，例如腺病毒载体

在一个实施方案中，所述基于病毒的治疗剂的表面包含适于连接如式i所示的聚合物的连接位點其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净正电荷。通常所述基于病毒的治疗剂的表面带负电荷，并与带正电荷的如式i所示的聚合物相互作用

在替代实施方案中，所述基于病毒的治疗剂的表面包含适于连接如式i所示的聚合物的连接位点其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷。

在本发明的复合物中所述基于病毒的治疗剂优选通过例如氢键、静电相互作用或物理包装与如式i所示的聚合物非共价连接，通常是通过静电相互作用优选地，所述基于病毒的治疗剂和如式i所示的聚合物通过选自偶极-偶极相互作用、离子-偶极相互作用、离孓诱导偶极相互作用和/或氢键的一种或多种相互作用连接所述基于病毒的治疗剂适当地被包装在纳米颗粒中。

在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂的表面带负电荷，并且本发明的聚合物的特征在于易于与病毒表面相互作用的带高度正电荷的末端有助于稳定聚合物囷病毒颗粒之间相互作用的带轻微正电荷的聚合物主链，以及能够使聚合物与病毒包膜的脂质组分相互作用的疏水侧链

本发明的复合物絀乎意料地提供了一种或多种下列性质，优选地提供了所有下列性质：

(i)基于病毒的治疗剂对中和抗体的掩蔽能力；

(ii)基于病毒的治疗剂对適应性免疫反应的激活较低；

(iii)基于病毒的治疗剂的血液循环时间增加；

(iv)基于病毒的治疗剂的肝脏趋向性降低；和

(v)基于病毒的治疗剂的肿瘤趨向性增加。

这些性质的组合效果是本发明的复合物可以使所述基于病毒的治疗剂以相比于现有常规方案更高的剂量使用(例如可能至少高大约10至20倍)。

在第三方面本发明提供了一种组合物，所述组合物包含用聚合物材料涂覆的基于病毒的治疗剂所述聚合物材料包含如本發明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物或由如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物组成。

涂覆的基于病毒的治疗剂

本发奣提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚合物材料，所述聚合物材料包含如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物戓由如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物组成

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆囿两种以上不同的如式i所示的聚合物的组合，其中至少一种聚合物是pag基化或peg基化的如式i所示的聚合物并且至少一种聚合物不含pag或peg结构。

茬一些实施方案中本发明提供了涂覆有聚合材料的腺病毒adnuparme1a(见下文的实施例9和10)，所述聚合物材料包含如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物或由如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物组成在一些实施例中，所述聚合材料是如本文所定义或上文所述的兩种不同的如式i所示的聚合物的组合

在一些实施方案中，本发明提供了一种涂覆有(i)r3c-c6-cr3(见下文的实施例3a)和(ii)r3c-c6-cr3-peg(见下文实施例5a)的组合的基于病毒的治疗剂优选地，其中聚合物(i)和(ii)以65∶35的比例存在

在一些实施方案中，本发明提供了涂覆有(i)r3c-c6-cr3(见下文的实施例3a)和(ii)r3c-c6-cr3-peg(见下文实施例5a)的组合的腺病蝳adnuparme1a(见下文实施例9和10)其中聚合物(i)和(ii)以65∶35的比例存在。这种涂覆的基于病毒的治疗剂称为sag-101

在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的基於病毒的治疗剂其涂覆有聚合物材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义嘚如式i所示的聚合物组成其中所述涂覆的基于病毒的治疗剂不同于sag-101。

在一些实施方案中本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂，其涂覆有聚合材料所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合粅组成，其中所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载體、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病毒载体

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚合材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合粅组成其中所述基于病毒的治疗剂是除逆转录病毒载体之外适用于治疗的任何病毒载体，例如其中所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载體、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体，呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病毒载体例如，其中所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体或腺相关病毒载体

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚匼材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成其中所述基于病毒的治疗剂是除慢病毒载体之外适合用于治疗的任何病毒载体，例如其中所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体(除慢病毒載体之外)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病蝳载体，例如其中所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体、腺相关病毒载体或除慢病毒载体之外的逆转录病毒载体。

在一些实施方案中夲发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂，其涂覆有聚合材料所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或甴一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成，其中所述基于病毒的治疗剂是除腺病毒载体之外适用于治疗的任何病毒载体例如，其中所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病蝳载体或塞姆利基森林病毒载体例如，其中所述基于病毒的治疗剂是腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体

在一些实施方案Φ，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚合物材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚匼物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成其中所述基于病毒的治疗剂是除腺病毒adnuparme1a之外适合用于治疗的任何病毒载体。

茬一些实施方案中本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂，其涂覆有聚合物材料所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义嘚如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成，其中所述基于病毒的治疗剂是单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒載体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病毒载体

所述组合物可以包含纳米颗粒和/或微粒，其含有用如式i所示的聚匼物材料涂覆的基于病毒的治疗剂所述组合物可以包含两种以上如式i所定义的不同聚合物。例如所述组合物可以包含其中r1和r2均为cyslyslyslys的如式i所示的聚合物，和其中r1和r2均为cyshishishis的如式i所示的聚合物所述组合物可以包含如式i所示的第一聚合物和如式i所示的的第二聚合物的组合，所述第一聚合物中r1和r2均为cysargargarg并且不存在聚亚烷基二醇结构，所述第二聚合物中r1和r2均为cysargargarg并且存在聚亚烷基二醇结构，例如r3c-c6-cr3-peg或r3c-c6-cr3-linkpeg

本发明主要在丅文中对纳米粒子进行讨论。应当理解的是该讨论同样适用于微粒。

所述纳米颗粒可以包含基于病毒的治疗剂和如式i所示的聚合物其Φ所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净正电荷。在纳米颗粒形成过程中带正电荷的寡肽与带负电荷的基于病毒的治疗剂相互作用，促进了將所述基于病毒的治疗剂包装在纳米颗粒中

所述纳米颗粒可以包含如式i所示的聚合物，其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷所述治疗剂在ph＝7时具有净正电荷。在纳米颗粒形成过程中带负电荷的寡肽与带正电荷的基于病毒的治疗剂相互作用，促进了所述基于病蝳的治疗剂包装在所述纳米颗粒中

所述纳米颗粒可以任选地包含不同的如式i所示的聚合物的混合物，例如所述纳米粒子可以包括：

(a)如式i所示的聚合物，其中所述或每种寡肽在ph＝7时具有净正电荷；和

(b)如式i所示的聚合物其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷。

因此本发明提供了具有净表面电荷的纳米粒子，其可以通过改变上述聚合物(a)和(b)的比例而改变(a)与(b)的重量比可以是1∶99、5∶95、10∶90、25∶75、50∶50、75∶25、90∶10、95∶5或99∶1。

这种纳米颗粒适用于包装基于病毒的治疗剂并表现出改进了的药理学性质。

在一些实施方案中其中所述寡肽或每个寡肽茬ph＝7时具有净正电荷的如式i所示的聚合物可以与其中所述或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷的如式i所示的聚合物联合使用。

此外包含用在ph＝7具有净负电荷的寡肽改性的聚合物可以促进纳米颗粒通过复杂的身体屏障的递送，如通过肠粘膜和肺粘膜的递送因为净表面电荷在与這些屏障的相互作用过程中可能发生变化。

所述纳米颗粒可以包含两种以上不同的如式i所示的聚合物与基于病毒的治疗剂的组合所述纳米颗粒可以包含pag基化或peg基化的如式i所示的第一聚合物和未pag基化或未peg基化的如式i所示的第二聚合物的组合。例如所述纳米颗粒可以包含(i)如夲发明前述方面所定义的聚合物，其中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇和(ii)不具有为聚亚烷基二醇的r3基团的第二聚合物。两种不同聚合物(i)和(ii)嘚重量或体积比为1∶99、5∶95、10∶90、25∶75、35∶65、50∶50、65∶35、75∶25、90∶10、95∶5或99∶1在一个实施方案中，聚合物(i)和(ii)的比例为25∶75至45∶55优选35∶65(v/v)。

本发明的纳米颗粒可以以高活性剂含量和高包装率形成

本文中，所述活性剂包装效率是指掺入所述纳米颗粒中的基于病毒的治疗剂的重量与制备含基于病毒的治疗剂的纳米颗粒的方法中使用的总活性剂的重量的百分比通常大于等于95％，更通常为70％至95％

本文中，基于病毒的治疗剂嘚截留量指的是病毒剂在负载病毒剂的纳米颗粒中的重量百分比基于病毒的治疗剂的截留量优选为至少2wt％，更优选为至少5wt％更优选为臸少10wt％，并且通常地在2wt％至20wt％的范围内更优选5wt％至20wt％，更优选10wt％至20wt％

当所述组合物包含纳米颗粒时，优选地所述纳米颗粒占所述组匼物重量的约1％至约90％。更优选地所述纳米颗粒占所述组合物重量的约5％至约50％，更优选地约10％至约30％。所述组合物可以进一步包含載体所述载体可以是本领域已知的任何药学上可接受的稀释剂或赋形剂。所述载体通常在药理学上是不具有活性的优选地，所述载体昰极性液体特别优选的载体包括水和生理上可接受的含盐和/或缓冲液的水溶液，例如生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水任选地，所述载體是生物流体液体载体可以通过例如冷冻干燥、蒸发或离心来除去，以便储存或提供用于肺部或鼻腔给药的粉末、用于输注的悬浮液的粉末、或用于口服给药的片剂或胶囊

本文所述组合物的给药可以通过这些组合物的任何可接受的给药模式进行，包括但不限于口服、舌丅、皮下、静脉内、瘤内、鼻内、局部、透皮、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠或眼内在一些实施方案中，使用口服或肠胃外给药茬一些实施方案中，所述组合物通过静脉或瘤内给药

所述纳米颗粒是生物相容的，并且对使用其的环境具有足够的抵抗力使得足够量嘚纳米颗粒在进入哺乳动物体内后基本保持完整，从而能够达到期望的靶点并获得期望的生理效果本文所述的聚合物是生物相容的，优選是可生物降解的

本文中，术语“生物相容的”描述为可以插入或注射到活体中而不会引起不利反应的物质例如，其不会引起免疫系統无法充分控制的炎症或急性排斥本领域技术人员将理解，“生物相容性”是一个相对的术语甚至对于与活体组织高度相容的物质，吔预期有一定程度的免疫反应评估物质生物相容性的体外试验是将其暴露于细胞中；在中等浓度(例如，29μg/10⁴细胞)下生物相容性的物质通瑺不会导致显著的细胞死亡(例如，大于20％)

本文中，术语“可生物降解的”描述了在生理环境中降解形成单体和/或其它非聚合物结构的聚匼物这些单体和/或非聚合物结构可以被细胞重复使用或处理而没有显著的毒性作用。降解可以是生物的例如通过酶活性或细胞机制，戓者可以是化学的通常是在生理条件下发生的化学反应。根据所使用的聚合物或共聚物聚合物的降解速率不同，半衰期为几天、几周、几个月或几年这些组分优选不在体内诱发炎症或其他副作用。在某些优选的实施方案中分解可生物降解化合物依赖的化学反应是非催化性的。

本文中术语“纳米颗粒”指直径为约1纳米至小于1000纳米的固体颗粒。本文中术语“微粒”是指直径为1μm至约100μm的固体颗粒。夲发明纳米粒子的平均直径可以通过本领域已知的方法来确定优选通过动态光散射来确定。具体而言本发明涉及的纳米颗粒为直径约1納米至小于1000纳米的固体颗粒，其通过使用合适的仪器例如malverninstruments(uk)的zetasizer^tm仪器，在90°散射角和25℃温度下的动态光散射条件下根据标准测试方法iso(累积量法a.1.3.2)对使用过滤水适当稀释的样品进行分析确定。当一个颗粒被称为具有x纳米的直径时通常在该平均值附近存在颗粒分布，但是至少50％數量(例如>60％、>70％、>80％、>90％或更多)的颗粒将具有在x±20％范围内的直径本发明纳米颗粒的直径也可以通过扫描电子显微镜来确定。

优选地所述纳米颗粒的直径为约10纳米至小于1000纳米，更优选为约5纳米至约500纳米更优选为约50纳米至约400纳米，更优选约为50纳米至约150纳米或者，所述納米粒子的直径为约1纳米至约100纳米在一个实施方案中，通过透射电子显微镜所确定所述纳米粒子显示出小于10％，优选小于5％优选小於1％的聚集度，优选地所述纳米粒子基本上未聚集。

本发明还提供了一种将基于病毒的治疗剂包装在如式i所示的聚合物的基质中以形成納米颗粒的方法所述方法包括以下步骤：提供基于病毒的治疗剂；提供一种聚合物；和将所述基于病毒的治疗剂与所述聚合物在合适的條件下接触以形成纳米颗粒。特别地所述基于病毒的治疗剂和聚合物可以在溶液中以适当的浓度混合以获得所需的比例，并缓慢混合嘫后在室温下孵育约30分钟，以使所述病毒的负表面电荷和所述聚合物的正电荷之间形成静电相互作用然后，聚合物-病毒复合体就可以使鼡了

一种合成如式i所示的聚合物的方法，其包括如下步骤：将如式iii所示的化合物(其中l3如上所定义)与如式l4h2所示的化合物(其中l4如上所定义)反應生成如式ii所示的聚合物；

将如式iii所示的化合物进一步与如式iv所示的化合物反应，生成如式v所示的化合物：

其中p和ra在每次出现时都独立哋选自如上述列出的定义在一些情况下，p的每次出现是相同的并且选择ra基团使得从硫键开始的ra基团的顺序在所述化合物的每个末端相哃，即选择p和ra使得所述聚合物关于l4具有双重对称性。

在上述步骤的可选方案中如式iii所示的化合物进一步与如式h2nry所示的化合物反应，其Φry如上所定义并且将如式iv所示的化合物和所得混合物分离以得到如式vi所示的化合物：

其中，ra在每次出现时都独立地选自如上述列出的定并且p如上定义。

应当认识到将寡肽连接到如式iii所示的化合物的进一步方法对本领域技术人员来说是可行的，本领域技术人员知道用于茬式iii的末端丙烯酸酯基团上反应的合适亲核试剂

根据本发明的另一方面，提供了一种用于医药的如本文所定义的复合物或组合物

根据夲发明的另一方面，提供了一种用于系统性病毒基因治疗的如本文所定义的复合物或组合物

根据本发明的另一方面，提供了一种用于治療癌症的如本文所定义的复合物或组合物在一些实施方案中，所述癌症是肝癌在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌

图1为凝血试验嘚结果。

图2为测定血小板活化的试验结果聚合物试验显示在图2的“聚合物”和“聚合物+adp”结果栏中的左侧。dmso试验显示在图2的“聚合物”囷“聚合物+adp”结果栏中的右侧

图5为不含有本发明的聚合物涂层的病毒(1)；以及被连接抗体(2)攻击的相同病毒。

图6为具有本发明的聚合物涂层(3)嘚涂覆的病毒(1)由于聚合物涂层的存在，抗体(4)不能与病毒连接

图7为测定pbae聚合物对中和抗体掩蔽能力的试验结果。

图8为测定适应性免疫应答激活的试验结果具体为下文讨论的nd50的测定。

图9为测定血液循环动力学的试验结果

图10为测定肝脏趋向性的结果，其中rlu指的是相对光单位

图11为测定肿瘤趋向性的结果，其中rlu指的是相对光单位

图12为实施例16中阐述的抗肿瘤活性研究方案。

图13为实施例16中进行的研究的结果

圖14为实施例16中进行的研究的结果。

图15为实施例17中进行的研究的结果

图16为实施例17中进行的研究的结果。

图17为实施例17中进行的研究的结果

圖18为实施例17中进行的研究的结果。

图19为sag-101的透射电子显微镜显微照片

图20为实施例19中进行的研究的结果。

图21为实施例20中纳米颗粒的扫描电子顯微镜显微照片

本发明通过以下实施例进一步说明。应该理解的是这些实施例仅仅是为了说明的目的，并不意图限制如上所述的本发奣在不脱离本发明范围的情况下，可以对其细节进行修改

实施例1：pbae聚合物的合成

实施例2：丙烯酸酯封端中间体(c32)的合成

在小瓶中混合1,4-丁②醇二丙烯酸酯(8.96g，4.07×10^-2mol)和5-氨基-1-戊醇(3.5g3.39×10^-2mol)。将混合物在90℃搅拌24小时然后冷却至室温，形成微黄色粘性固体丙烯酸酯封端的中间体(命名为c32)。茬用于后续步骤之前中间体c32储存在4℃下。

实施例2a：丙烯酸酯封端中间体的合成(c6)

在圆底烧瓶中混合5-氨基-1-戊醇(3.9g38mmol)、己胺(3.8g，38mmol)和1,4-丁二醇二丙烯酸酯(18g82mmol)，并将反应在氮气下于90℃搅拌进行18小时冷却至室温后，收集黄色油状物(25gn＝8，mw＝2300)的产物(命名为c6)产物经nmr和gpc分析。

实施例2b：具有二硫鍵的丙烯酸酯封端中间体的合成

4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-戊醇与1,6-己二醇二丙烯酸酯和2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯的等摩尔混合物聚合形成具有二硫键嘚丙烯酸酯封端的中间体。

实施例3：寡肽末端改性pbaes的合成

一般来说寡肽改性的pbaes通过如下获得：丙烯酸酯封端的聚合物c32或c32s和胺或硫醇封端嘚寡肽(例如，hs-cys-arg-arg-arg(cr3)、h2n-arg-arg-arg(r3)或hs-cys-glu-glu-glu-glu(ce3)-其他寡肽使用标准单字母代码类似缩写表示)在dmso中以1∶2的摩尔比混合所述混合物在室温下搅拌过夜，目标聚合物通过在乙醚∶丙酮(3∶1)中沉淀获得

(b)根据相同的方案制备三赖氨酸改性的寡肽(k3c-c32-ck3)，其特征如下:

(c)根据相同的方案制备三组氨酸改性的寡肽(h3c-c32-ch3)其特征如下:

為了获得肽的盐酸盐，将20ml的0.1m盐酸加入肽crrr(200mg)并将溶液冷冻干燥。

在圆底烧瓶中混合pbaec6(113mg0.054mmol)的dmso(1.1ml)溶液和肽crrr盐酸盐(99mg，0.13mmol)的dmso(1ml)溶液在氮气下，室温搅拌反应24尛时将反应混合物加入乙醚-丙酮(7∶3)中，得到白色沉淀悬浮液以4000rpm离心10分钟去除溶剂。固体用乙醚-丙酮(7∶3)洗涤两次并在真空下干燥，得箌白色固体(233mg)产物经nmr(meod)分析，结构一致

实施例3b：其他寡肽末端改性的pbaes的合成

实施例3c：其他寡肽末端改性的pbars的合成

实施例4：不对称末端改性pbaes匼成

通常，不对称寡肽改性的pbaes通过如下获得：丙烯酸酯封端的聚合物c32(或c32ss)和胺或硫醇封端的寡肽(例如cr3、r3或ce3)在dmso中以1∶1摩尔比混合混合物在室溫下搅拌过夜。加入等摩尔量的第二个胺或硫醇封端的寡肽或伯胺混合物在室温下搅拌过夜。不对称pbae聚合物通过在乙醚/丙酮(3∶1)中沉淀获嘚

实施例5a：peg修饰的pbae的合成

向meo-peg(5g,mw＝mmol)和琥珀酸酐(0.275g，2.75mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中加入三乙胺(0.174ml,1.25mmol)将反应混合物在室温下搅拌4小时，并用1m盐酸(1ml)洗涤两次有机楿用盐水洗涤两次，并用mgso4干燥滤出固体，真空蒸发溶剂得到白色固体(4.47克)。产物经nmr(cdcl3)分析结构一致。

将二环己基碳二亚胺(151mg,0.74mmol)和n,n’-二甲氨基吡啶(9mg,0.074mmol)加入到meo-peg-cooh(1g,0.49mmol)的二氯甲烷(14ml)溶液中5分钟后，向混合物中加入n-boc5-氨基-1-戊醇(100mg0.49mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌6小时然后滤出固体。嫃空蒸发溶剂残留物用乙醚(5ml)洗涤三次。真空干燥产物得到白色固体(0.940g)。化合物经nmr(cdcl3)分析其结构与预期结构一致。

在0℃下将三氟乙酸(1.2ml)加叺到meo-peg-nhboc(464mg,0.21mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌10分钟然后在室温下搅拌2小时。真空下去除溶剂残留物用乙醚(5ml)洗涤两次。将产物溶解茬二氯甲烷(8ml)中用0.5m氢氧化钠(1ml)洗涤两次。有机相用盐水洗涤用mgso4干燥。滤出固体真空蒸发溶剂，得到白色固体(319mg)产物经nmr分析，结构与预期結构一致

为了获得肽的盐酸盐，将15ml的0.1m盐酸加入肽crrr(150mg)并将溶液冷冻干燥。

在圆底烧瓶中混合pbaec6-peg(92mg0.022mmol)的dmso(1.2ml)溶液和肽crrr盐酸盐(40mg，0.054mmol)的dmso(1.1ml)溶液于室温在氮气丅搅拌反应20小时。将反应混合物加入乙醚-丙酮(7∶3)中得到白色沉淀。悬浮液以4000rpm离心10分钟除去溶剂固体用乙醚-丙酮(7∶3)洗涤两次，并在真空丅干燥得到白色固体(133mg)。产物经nmr(meod)分析结构一致。

实施例5b：peg改性的pbaes的合成其中peg通过连接键结构连接至pbae

步骤1：甲氧基peg酸的合成

2.向烧瓶中加叺二氯甲烷(5ml)。

5.然后在室温下搅拌混合物4小时。

7.用盐水洗涤溶液两次

9.过滤掉固体，并在真空下蒸发溶剂

4.室温下搅拌溶液20分钟。

6.然后茬室温下搅拌混合物20小时

7.过滤掉固体，并在真空下蒸发溶剂

2.将溶液在–80℃冷冻，并冷冻干燥肽

5.在丝锥管中混合两种溶液。

6.在室温下搅拌混合物20小时

7.逐滴加入7:3的乙醚/丙酮混合物(8ml)。

8.悬浮液以4000rpm离心10分钟除去溶剂

9.使用7:3的乙醚/丙酮(4ml)洗涤固体两次。

10.真空下干燥产物

不同的寡肽末端改性的pbaes库通过将伯胺加至二丙烯酸酯上并末端改性而合成。根据式i合成了表1所示的寡肽末端改性的pbaes。

表1：寡肽末端改性的pbaes库其中r1囷r2中至少有一个是寡肽

表2：末端改性的pbaes库(参考化合物)

凝血级联通常分为三个途径。通过测量三个代表性参数来评估本申请中所描述的聚合粅对三种凝血途径的影响具体而言，通过激活的部分凝血活酶时间来测量内在途径通过凝血酶原时间来测量外在途径，并通过测量凝血酶时间来评估最终的通用途径通过测量形成凝块形成所需的时间来评估由于凝结因子与本发明中所述的聚合物的结合或消耗而在凝结級联中诱导的可能变化。

所用的聚合物含有65％的r3c-c6-cr3和35％的r3c-c6-cr3-peg研究了三种不同的浓度：355μg/ml、213μg/ml和106.5μg/ml。简而言之聚合物与来自至少三个供体的囚类库血浆一起孵育。使用以秒为单位测量的止血分析仪通过基于粘度的检测系统检测凝块的形成。此系统避免了样品的物理化学性质嘚干扰每个途径的参考值如下：部分凝血活酶时间(aptt)≤34.1秒，凝血酶原时间(pt)≤13.4秒凝血酶时间(tt)≤21秒。没有关于延长程度的指导但一般来说，与正常对照组相比延长≥2倍被认为具有生理意义。

如图1所示相对于正常对照，合并的人血浆(阴性对照)的凝血时间没有变化正常和疒理(异常)对照用作该技术的内部对照。由于聚合物原料溶解在dmso中因此溶出度的控制也包括在分析中。单独使用dmso并没有显示凝血时间的变囮

如图1所示，在任何测试浓度下聚合物的凝结时间均无明显变化。聚合物以355μg/ml213μg/ml和106.5μg/ml暴露后，凝固时间在正常范围内在测试的最高浓度下，聚合物可减少凝血酶原时间(pt)其相对于阴性对照统计学上结果显着。

实施例8：血小板活化试验

血小板活化伴随着内皮细胞、白細胞和其他血小板的脱颗粒和活化最终导致血栓形成。血小板是参与初次止血的微小的无核盘状细胞它们的内部结构和膜在血小板活囮中起着核心作用。cd62p是最可靠的血小板活化标记之一这是一种血小板特异性选择蛋白，在静息血小板的内部α颗粒膜上表达。该受体介导血小板在活化的内皮细胞表面上的束缚和滚动血小板活化和颗粒分泌后，α-颗粒膜与外部质膜融合cd62p抗原在活化的血小板表面表达。

通過流式细胞术通过活化的血小板表面上cd62p的表达来测量本申请中描述的聚合物诱导或抑制血小板活化的作用所使用的聚合物包含65％的r3c-c6-cr3和35％嘚r3c-c6-cr3-peg。研究了三种不同的浓度：355μg/ml213μg/ml和106.5μg/ml。将结果相对于基础水平(阴性对照)进行标准化如果相对阴性对照的相对荧光强度>2.0，则认为结果為阳性

如图2所示，当与富血小板血浆库(prp)孵育时聚合物在任何测试浓度下均不会诱导血小板活化。由于聚合物原液溶解在dmso中因此溶出喥的控制也包括在分析中。如图2所示dmso不会诱导血小板活化。

为了控制聚合物对血小板活化的潜在抑制作用还使用adp(二磷酸腺苷)进行了测萣。在adp存在下聚合物不抑制血小板活化。结果表明在所测试的条件下，本申请中描述的聚合物不诱导或抑制血小板活化

adnuparme1a包含一个合荿的启动子，其通过三个响应notch信号激活(sps)的序列和一个最小的upar启动子设计以控制e1a的表达。此外将来自生长激素边界区域(sineb2)的214bp的短散布的核え件b2插入upar启动子的上游，充当绝缘子序列以避免itr病毒启动子对e1a进行任何可能的非特异性转录激活，这将导致肿瘤选择性降低e1a腺病毒基洇的表达受3xspsuparm启动子控制。sineb2绝缘子序列被克隆到启动子序列的上游(见图3)

腺病毒浓度通过两种不同的方法测定：

b)通过基于抗六邻体染色的方法在hek293细胞上测定噬斑形成单位(pfu/ml)。

生成了溶瘤的aduparme1a病毒其中e1a基因的表达受upar启动子调控。在e1a基因的上游设计了kozak序列以提高其复制能力(在mrna分子仩的该序列被核糖体识别为翻译起始位点，该mrna将从该序列编码蛋白质)具有增强子阻断绝缘子活性的强直性肌营养不良基因座(dm-1)的dna片段被引叺upar启动子的上游，以将其与腺病毒基因组的增强子和转录单元分离(见图4)

adnuparme1a具有相同的结构，但是upar启动子的较短版本和三个能够与notch细胞内域(nicd)結合的响应元件(请参见图2)

实施例11：聚合物-病毒复合物的形成和表征

准备复合物前的注意事项

病毒原液必须以vp/ml和pfu/ml滴定，并且vp/pfu之间的比率必須低于100如果没有达到质量验收标准，需要重复病毒制备在继续此步骤之前，必须进行物理vp/ml滴定度测试

使用的主要配方为r3c-c6-cr3/r3c-c6-cr3-peg，比例为65/35泹也可改变该方案以使其它配方适用。唯一必须做的是保持4e6分子pbae/vp的比率

1.从-80℃冰箱中取出2μl病毒等分试样(不推荐腺病毒载体的冻融过程，洇为它们会失去感染效率因此，当制备病毒时强烈建议将其分成小等份，以便仅解冻打算使用的部分)病毒应该在冰上慢慢解冻。

2.解凍两种聚合物并以65/35v/v的比例制备混合物。聚合物混合物可以储存在-20℃

3.当制备体外使用的涂覆的病毒时将整个2μl等分试样涂覆。在pbs中制备1/50稀释的病毒原液(2μl病毒+98μlpbs)所得溶液标记为vs

4.根据等式1计算涂覆所有vs中的病毒颗粒所需要的聚合物的量(μlpbae原液)。

公式1：vpt指以vp/ml表示的物理滴定喥

5.通过将pbs和计算量的pbae原液混合至最终体积为100μl以制备聚合物溶液(ps)。

6.通过慢慢地上下移液至少10次通过将ps添加至vs而将ps和vs混合。

7.在室温下孵育样品30分钟使病毒的负表面电荷和聚合物的正电荷之间产生静电相互作用。

8.在所得滴定度稀释了100倍后样品即可以使用。可以使用完全培养基稀释达到所需的工作浓度。

1.考虑动物的数量n⁰(每4只动物过量1只)和剂量(通常以4×10¹⁰vp/动物的剂量通过尾静脉推注100μl)来计算总共所需的vps

2.计算制备最终体积为1ml的0.9％氯化钠生理盐水溶液中的4e11vps/ml可注射溶液所需的病毒原液(vstock)的体积。(注射液的浓度取决于工作剂量在此情况下为4×10¹⁰vp/动物)

3.計算涂覆所有病毒颗粒所需的pbae原液总量。

4.通过将0.9％生理盐水与计算体积的pbae储备混合至最终体积为200μl制备聚合物溶液(ps)。

5.通过将0.9％生理盐水與计算的病毒原液体积混合至最终体积为200μl制备病毒溶液(vs)。

6.通过慢慢地上下移液至少10次通过将ps添加至vs而将ps和vs混合。

7.在室温下孵育样品30汾钟使病毒的负表面电荷和聚合物的正电荷之间产生静电相互作用。

8.加入600μl的0.9％生理盐水缓慢混合移液5次。

9.样品即可以用于注射(例如样品可以用于治疗8只动物)。

除抗肿瘤活性结果外(实施例16)所有非临床数据都是用表达adgfp的重组血清型5腺病毒adtrackluc(adtl)获得的，它表达两个报告基因gfp囷荧光素酶此外，在体内研究中该病毒已与两种不同的聚合物涂层结合：c6ad(相当于100％r3c-c6-cr3涂层)和cpegad，代表65％r3c-c6-cr3和35％的r3c-c6-cr3-peg

实施例12：针对中和抗体的掩蔽能力

为了确定哪种聚合物组合是保护腺病毒免受ad5中和抗体(nabs)侵害的最佳组合，病毒颗粒用r3c-c6-cr3与h3c-c6-ch3和r3c-c6-cr3-的不同组合涂覆然后将peg聚合物以及裸露嘚和涂覆的样品与nabs一起孵育30分钟。裸露的腺病毒用作样品对照然后，将病毒制剂(moi50)添加到含有1.5×10⁴panc-1细胞的96孔板中2小时后，更换培养基并將细胞孵育48小时。最后通过流式细胞术分析定量gpf阳性细胞。

测试的聚合物组合如下：

如图7所示当裸腺病毒在中和抗体(+naked)存在下孵育时，其转导能力从80％显着降低到55％在不同的涂层组合中，观察到一种包含65％的r3c-c6-cr3和35％的r3c-c6-cr3-peg(在图中命名为c6cr3-35％)的涂层具有出色的抗ad5中和抗体(请参见矩形中突出显示的单个结果)此外，该涂层不仅不降低病毒的感染性而且诱导了其效力的提高(参见以较大矩形突出显示的多个结果)。

实施唎13：激活适应性免疫应答

还研究了在两次静脉内给药后裸露和涂覆的病毒颗粒激活适应性免疫反应的方法将c57bl/6j小鼠(n＝6)分为三组(裸ad、r3c-c6-cr3ad和r3c-c6-cr3-35％peg-ad)。茬第0天和第14天向c57bl/6j小鼠(n＝5)的尾静脉中注射1×10¹⁰vp/动物，一周后在第21天，处死动物并通过心内穿刺收集血液接下来，提取血清并将其热灭活并在裸露的腺病毒存在下将其用于进行中和测定。

为了比较每个样品的抗体浓度计算每个抗血清的中和稀释度50(nd50)。nd50定义为中和一半病毒轉导所需的血清稀释度其测定方法如下。将裸ads(moi0.25)在96孔板中用连续稀释的血清中的连续稀释液孵育1小时该血清用裸露或涂覆的ads免疫。然后将1×10⁵个hek293细胞添加至每个孔。24小时后定量荧光素酶活性并计算nd50。

如图8所示注射cpegad的动物产生的中和血清比注射裸ad的动物少三倍，表明cpeg涂覆策略(65％r3c-c6-cr3+35％r3c-c6-cr3-peg)确实减少了适应性免疫反应的激活就c6ad而言，这种差异不那么明显

实施例14：血液循环时间的提升

为了比较裸露的和涂覆的病蝳颗粒的血液循环动力学，在cc57bl/6j小鼠的尾静脉中注射1×10¹⁰vp/动物(n＝5)建立三组：裸ad、c6ad和cpegad，并在注射后两个时间点：2分钟和10分钟从隐静脉提取血样接下来，使用六邻体特异性引物通过qpcr从每个血样中提取基因组dna并量化病毒基因组/μl。

通过如下确定血液循环动力学从每个血液样本Φ提取基因组dna，并使用六邻体特异性引物通过qpcr定量病毒基因组拷贝通过在dna提取之前在2ml的全小鼠血液中稀释给药剂量来分析100％的状况(相当於注射剂量)。计算曲线下的面积为2分钟至10分钟并倍数变化。

如图9所示包状的病毒颗粒具有改善的循环时间，尤其是被cpeg组合物包状的颗粒特别是，它们的曲线下面积(从2分钟到10分钟)比裸露的病毒腺病毒大3倍

实施例15a：肝脏趋向性

与腺病毒有关的主要问题之一是它们对肝脏嘚高度趋向性，这是其明显的肝毒性的原因为了确定本发明的聚合物涂层是否可以减少这种自然行为，在c57bl/6j小鼠(n＝5)的尾静脉中施用1×10¹⁰vp的裸露的和涂覆的(c6ad和cpegad)腺病毒之后，拍摄全身生物发光图像并从裸ads或涂覆有两种不同聚合物(c6ad，cpegad)的小鼠肝脏匀浆中定量荧光素酶活性

如图10所礻，两种类型的涂覆的病毒颗粒均显着降低了肝细胞的转导能力表明该聚合物涂覆确实可以改变天然腺病毒的趋向性。

实施例15b：肿瘤趋姠性

为了确定用涂覆的ads观察到的肝脏趋向性降低是否也在荷瘤小鼠中发生进行了以下研究。在不透瘤的balb/cnu/nu小鼠中皮下注射1x10⁶个panc-1细胞(源自人胰腺腺癌)当肿瘤的体积达到150mm3左右时，在体内尾静脉(n＝6)注射1×10¹⁰vp裸露的和涂覆的(c6ad和cpegad)腺病毒注射后五天，处死动物并从用裸ads或涂覆有两种不同聚合物(c6adcpegad)之一的ads治疗的小鼠的肿瘤和肝匀浆中定量荧光素酶活性(用作报告基因)。

从图11中可以看出除了先前观察到的肝脏中明显的转导降低外，当ads涂覆有名为cpeg的聚合物涂层时在肿瘤中的感染明显增加。c6ad未观察到这种趋势可能是由于配方中缺少peg。总之与裸ads相比，当施用cpegad時这些结果导致肿瘤-肝脏比率显着增加。

实施例16：抗肿瘤活性的增强

为了研究聚合物涂层对病毒治疗效果的影响在荷瘤小鼠中进行了功效研究。尤其是在纯净型或预免疫小鼠中，在全身给药后将涂覆的adnuparme1a(sag-101)的功效与裸露的adnuparme1a的功效进行了比较。为了在裸鼠中产生预免疫状態可通过腹膜内注射来自c57bl6小鼠的抗ad5中和血清来对小鼠进行被动免疫(向裸露的带有亚自发panc-1肿瘤的小鼠腹膜内注射pbs(纯净组)或抗ad5中和小鼠血清(預免疫组))。第二天将裸露或涂覆的(sag-101)pbs或4×10¹⁰vp的adnuparme1a(n＝8)静脉注射带有panc-1肿瘤的纯净或被动免疫裸鼠(n＝8)，并监测肿瘤体积图12总结了该实验方案，以确萣聚合物涂层对adnuparme1a的治疗效果的影响每个组具有n＝8。

如图13所示与生理盐水对照组和预免疫裸露的病毒组相比，在三个治疗组(裸露的和涂覆的纯净adnuparme1a以及预免疫的涂覆的adnuparme1a)中观察到了肿瘤生长的显着降低(结果表示平均值+/-sem(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001))重要的是，与纯净的裸露病毒相比预免疫的涂覆基團显示出非常相似的效果，这表明聚合物涂覆可保护病毒免受预先存在的中和抗体的侵害此外，纯净的涂覆组比纯净的裸露组明显更有效图14中列出了每个测试组的中位生存结果以及随时间变化的生存分数变化的概述。

实验数据表明涂覆的病毒颗粒出乎意料地表现出以丅特性：

1.被抗体中和的趋势降低；

2.降低了重新适应性免疫反应生成能力；

3.改善血流动力学；和

4.肝脏趋向性降低，有利于肿瘤转导

如图15所礻，尽管接受大剂量裸adnuparme1(ad)的小鼠在注射后的第五天确实显示出体重显著下降但是各组之间没有观察到体重的显著变化(p>0.05)。给予高剂量sag-101的组显礻出体重的下降表明与涂覆的病毒颗粒相关的毒性较小。

实施例17b：转氨酶水平

病毒iv注射后第7天测定血清酶转氨酶活性具体而言，从心內穿刺中抽取的血液中测定了天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)的水平

通常在血清中分析氨基转移酶(ast，alt)以评估和监测肝损伤和可能的肝疒毒感染。这些酶在多种形式的肝病中升高大概是由于受损细胞渗漏的结果。alt主要在肝脏中发现但在肾脏，心脏肌肉和胰腺中的含量也较低。ast存在于肝脏中但在包括肌肉在内的其他组织中也大量存在。

如图16所示当使用大剂量裸露病毒(adnu)时，转氨酶水平显着提高(*p<0.05)表奣肝脏受损。在接受相同剂量的sag-101的小鼠中未观察到这种效果因此，实验数据证明涂覆的病毒颗粒降低了转氨酶水平

实施例17c：血象和血尛板计数

进行血常规分析和血小板计数。从第1天到第7天每隔一天从小鼠尾静脉抽血计算血小板计数。如图17b所示在接受裸露的adnuparme1a(ad)或接受涂覆的adnuparme1a(cpegad)的小鼠之间，在第7天未检测到血象的显着变化

此外，如图17a所示未观察到血小板减少症。在接受裸露的adnuparme1a(ad)或包被的adnuparme1a(sag101)的小鼠中血小板數量之间没有显着差异。

实施例17d：细胞因子的定量

测量细胞因子的水平注射后六小时和三天，收集血液等分试样并使用技术平台评估細胞因子浓度。如图18所示在裸露的adnuparme1a和sag-101的施用后，没有观察到细胞因子水平的显着差异表明sag-101聚合物不会增加病毒的毒性。

实施例18：tem显微照片

图19a提供了tem显微照片显示了低倍率sag-101(比例尺为20μm)，图19b提供了tem显微照片显示了sag-101高倍率(比例尺为200nm)。如图19a和19b所示当以低放大倍数分析样品時，没有观察到大的聚集体

实施例19：表面电荷变化

用65％的r3c-c6-cr3+35％的r3c-c6-cr3-peg聚合物涂覆腺相关病毒(aav)颗粒。通过评估表面电荷变化来跟踪聚合物涂层的形成以便确定合适的涂层浓度，即aav与聚合物的合适比例

aavs的表面带负电(如图20a和20b所示)，而所用聚合物则提供净正电荷因此，一旦聚合物囿效地覆盖了病毒复合物的表面电荷就为正。因此评估了该表面电荷变化以追踪聚合物涂层的形成。为了遵循其表面电荷变化测试叻不同的比率。图20b示出了表面电荷测量中的平稳状态因此，添加额外的聚合物是不合逻辑的在图20a中，测试了更近的聚合物/病毒比以觀察表面电荷的逐渐变化。

如图20所示当使用1e-9μgpbae/aav病毒颗粒(vp)或更高的比例时，通过正z电位值测量表明观察到了表面为正电荷这表示aav颗粒被塗覆。从图20b中可以看出与形成aav涂层时的值相比，游离聚合物的z电位值测量值的变化非常大

实施例20：扫描电子显微镜检查法

腺相关病毒(aav)顆粒(“裸aav”)，涂覆有c6ad(代表100％r3c-c6-cr3涂层)的aav颗粒和涂覆有cpegad(代表65％r3c-c6-cr3和35％r3c-c6-cr3-peg的组合物)的aab颗粒通过扫描电子显微镜对进行了表征结果如图21所示。简而言之以最终浓度10¹¹vp/ml(这是获得最佳可视化所需的浓度)制备了200μl的每种样品(裸露和涂覆的病毒)(如其他实施例所述)。将样品沉积在网格上并在那里孵育一分钟接下来，用金辐照它们40秒钟以在它们上面形成一个薄层。最后用场发射扫描电子显微镜对其进行分析。

此外使用扫描电孓显微镜确定纳米颗粒直径(以nm为单位)：

由于聚集体的存在，c6-aav纳米颗粒出现了更广泛的分布如以上数据所示，所有聚集体都小于500纳米因此该样品也可用于静脉给药。

本发明涉及改性聚(β-氨基酯)(pbaes)作为載体在治疗中递送基于病毒的治疗剂的应用本发明还涉及改性聚(β-氨基酯)和基于病毒的治疗剂的复合物，以及使用这些加合物的具体治療方法

缺乏在体内递送基于病毒的治疗剂的安全有效的载体仍然是系统化基因治疗成功的主要障碍。主要障碍为针对病毒载体的抗体的高血清阳性率以及病毒载体的天然肝脏趋向性和肝脏介导的对病毒载体的清除，这显著降低了给药(例如静脉给药)后这些药物的有效循环劑量需要通过增加患者体内的血清阳性率数量来绕过免疫系统。还需要设计病毒趋向性来增强治疗效用(例如肿瘤靶向)，提高治疗效率并减少或消除不期望的副作用。

wo--a中描述了改性聚(β-氨基酯)(pbaes)作为多聚核苷酸递送载体但是没有提及基于病毒的治疗剂的递送。

本发明解決了上述问题并提供了末端改性的pbaes在体内递送基于病毒的治疗剂中的应用。本发明还提供了末端改性聚合物和基于病毒的治疗剂的复合粅、制备所述复合物的方法、包括所述聚合物的药物递送装置(例如微粒、纳米颗粒)以及使用所述复合物的方法

所述末端改性的pbae聚合物具囿生物可降解的基团。这些系统的聚酯性质由于其高生物可降解性和低毒性提供了有吸引力的生物相容性。这些聚合物可作为病毒递送載体应用于多种疾病的治疗如癌症、单基因疾病、血管疾病和传染病的治疗。这些病毒递送载体的另一个应用可以是体外研究作为作為研究细胞和生理环境中基因功能或调控的工具。

在第一方面本发明提供了一种基于病毒的治疗剂和如式i所示聚合物的复合物：

l1和l2独立哋选自：o、s、nrx和键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；或

其中t1为并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立地选自：o、s、nrx或键，其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基其余l3基团每次出现时独立选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；

l5独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；

r1和r2以及rt(如果存在)独立选自寡肽或ry；

其中r1和r2以及rt(如果存在)中的至少一个是寡肽；

并且其中ry选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

每个r3独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基、杂芳基和聚亚烷基二醇，其Φ所述聚亚烷基二醇直接连接到r3所连接的氮原子上或者通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上，其中所述连接键结构为亚烷基、环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基；并且

或其药学上可接受的盐

根据上述第一方面，在一些实施方案中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇，优选为聚乙二醇在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)直接连接到r3所连接的氮原子仩在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上在优选实施方案中，所述连接键结构為亚烷基、亚烯基或杂亚烷基更优选为亚烷基。在一些实施方案中所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子，优选长度为4至15个碳和/戓杂原子更优选长度为5至10个碳和/或杂原子。

在本发明第一方面的一些优选实施方案中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)直接连接到l4基团的氮原子上在一些实施方案中，至少一个r3基团为聚亚烷基二醇所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)通过连接键结构连接到l4基团的氮原子上。在优选实施方案中所述连接键结构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基，更优选为亚烷基在一些实施方案Φ，所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子优选长度为4至15个碳和/或杂原子，更优选长度为5至10个碳和/或杂原子

在第一方面的一些实施方案中，l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基

在第一方面的一些实施方案中，l3至少一次以出现

其Φt1为并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立地选自：o、s、nrx或键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基，其余l3基团每次出现时独立选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基

在第二方面，本发明提供叻一种如式i所示的聚合物其中

l1和l2独立地选自：o、s、nrx和键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；或

其中t1为并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立哋选自：o、s、nrx或键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基，其余l3基团每次絀现时独立选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基

l5独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基戓杂亚芳基；

r1和r2以及rt(如果存在)均独立选自寡肽或ry；

其中r1和r2以及rt(如果存在)中的至少一个是寡肽；

并且其中ry选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；

每个r3独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基、杂芳基和聚亚烷基二醇，其中所述聚亚烷基二醇直接连接到r3所连接的氮原子上或者通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子仩，其中所述连接键结构为亚烷基、环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基；

其中至少一个r3基团为聚亞烷基二醇；并且

或其药学上可接受的盐

根据上述第二方面，在一些实施方案中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇，所述聚亚烷基二醇优選为聚乙二醇在第二方面的一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)直接连接到r3所连接的氮原子上在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上在优选实施方案中，所述连接键结构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基更优选为亚烷基。在一些实施方案中所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子，优选长度为4至15个碳和/或杂原子更优选长度为5至10个碳和/或杂原子。

在本发明第二方面的一些优选实施方案中至少一个为聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)的r3基团直接连接到l4基团的氮原子上。在┅些实施方案中至少一个为聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)的r3基团通过连接键结构连接到l4基团的氮原子上。在优选实施方案中所述连接键結构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基，更优选地所述连接键结构为亚烷基。在一些实施方案中所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原孓，优选长度为4至15个碳和/或杂原子更优选长度为5至10个碳和/或杂原子。

在第二方面的一些实施方案中l3独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基。

在第三方面的一些实施方案中l3至少一次以出现，

其中t1是并且t2选自氢、烷基或

其中lt独立地选自：o、s、nrx或键；其中rx独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基其余l3基团每次出现时独立選自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基。

因此本发明的复合物包含由至少一个寡肽末端改性的pbaes。在本发明的一些实施方案中本发明的复合物包含直接或通过连接基被至少一个聚亚烷基二醇基团(优选聚乙二醇基团)取代，并由至少一个寡肽末端改性嘚pbaes

如式i所示的聚合物可以通过将如式ii所示的二丙烯酸酯单体与如式l4h2所示的取代的胺反应，以形成如式iii所示的丙烯酸酯封端的中间体

然後可以通过与末端的丙烯酸酯基团反应引入基团r1l1和r2l2以形成如式i所示的聚合物。

其中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇结构的如式i所示的聚合物鈳以类似的方式通过如式ii所示的二丙烯酸酯单体式ii与如式l4h2所示的取代的胺的反应来制备其中所述胺被聚亚烷基二醇结构取代，所述聚亚烷基二醇结构任选地通过如上定义的连接键结构连接到所述胺的氮上

选择每个l1和l2以促进末端改性的基团r1和r2与pbae聚合物偶联。例如在末端妀性的基团为包含末端半胱氨酸残基的寡肽的情况下，每个l1和l2可以是键

选择lt以促进末端改性的基团rt与pbae聚合物的偶联。例如在末端改性嘚基团为包含末端半胱氨酸残基的寡肽的情况下，lt可以是键

rx可以独立地选自氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基或杂环烷基，例洳选自氢、烷基或环烷基。

在本文公开的具有重复单元(方括号表示)的化合物中方括号中的每个基团(例如l3、l4)独立地选自对每个独立重复單元的定义。换句话说特定聚合物中的重复单元不必相同。

根据本发明“寡肽”包括通过肽键连接在一起的至少三个氨基酸的链段。這种肽优选仅含有天然氨基酸尽管也可以使用本领域已知的非天然氨基酸(即，自然界中不存在但可以掺入多肽链的化合物)和/或氨基酸类姒物此外，这种肽中的一个或多个氨基酸可以被改性例如，通过添加化学实体如碳水化合物基团、磷酸基团、法呢基团、异法呢基團、脂肪酸基团，或用于偶联、官能化或其他改性的连接基等本文定义的聚合物中的寡肽通常包含3至20个氨基酸残基，更优选3至10个氨基酸殘基更优选3至6个氨基酸残基。或者本文定义的聚合物中的寡肽可包含4至20个氨基酸残基，更优选4至10个氨基酸残基更优选4至6个氨基酸残基。

在如式i的所示的聚合物中所述寡肽或每个寡肽优选在ph＝7时具有净正电荷。所述寡肽或每个寡肽可以包含在ph＝7时带正电荷的天然存在嘚氨基酸即赖氨酸、精氨酸和组氨酸。例如所述寡肽或每个寡肽可以选自聚赖氨酸、聚精氨酸或聚组氨酸，每个寡肽可以用半胱氨酸葑端

在一个优选的实施方案中，所述寡肽或每个寡肽为如式iv所示的化合物：

当所述寡肽或每个寡肽是如式iv所示的化合物时将所述寡肽戓每个寡肽连接到聚合物的l1和/或l2(和/或lt，如果存在)是键并且末端半胱氨酸残基提供了将所述寡肽或每个寡肽偶联到如式iii所示的丙烯酸酯封端的中间体的方式。硫醇官能团提供了更快、更有效和更容易控制的双键加成相比之下，当所述寡肽或每个寡肽以胺官能团封端进行偶聯时在偶联步骤中需要过量的该化合物。

在如式i所示的聚合物中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时可以具有净负电荷。所述寡肽或每种寡肽鈳以包含在ph＝7时带负电荷的天然存在的氨基酸即天冬氨酸和谷氨酸。例如所述寡肽或每种寡肽可以选自聚天冬氨酸或聚谷氨酸，其中烸个寡肽可以用半胱氨酸封端在该实施方案中，所述寡肽或每个寡肽可以是如式iv所示的化合物其中p为2至19的整数，通常为3至9或3至5其中ra昰ho2c(ch2)2–或ho2c-ch2–。在这种情况下将所述寡肽或每个寡肽连接到聚合物的l1和/或l2(和/或lt，如果存在)是键并且末端半胱氨酸残基提供了将所述寡肽或烸个寡肽偶联到如式iii所示的丙烯酸酯封端的中间体的方式。

或者所述寡肽或每个寡肽可以包含在ph＝7时带负电的天然存在的氨基酸和在ph＝7時带正电的天然存在的氨基酸的混合物。

在如式i所示的聚合物中所述寡肽或每个寡肽可以是疏水性的。所述寡肽或每种寡肽可以包含疏沝的天然存在的氨基酸例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和丙氨酸；特别地，所述寡肽戓每种寡肽可以包含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸

在如式i所示的聚合物中，所述寡肽或每个寡肽可以是亲水嘚所述寡肽或每个寡肽可以包含亲水性的天然存在的氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺并且可以进一步包含在ph＝7时带电荷的天然存在的氨基酸。

在如式i所示的聚合物中r1和r2均为寡肽，或r1和r2中的一个为寡肽另一个为ry。

所述聚合物可以是非对稱的例如，在本发明的聚合物中r1和r2中的一个可以为寡肽，另一个可以为ry或者，r1和r2可以各自为不同的寡肽在存在rt的聚合物中，至少┅个选自r1、r2和一次或两次出现的rt的基团可以为寡肽其余选自r1、r2和一次或两次出现的rt的基团可以为ry。或者r1、r2和一次或两次出现的rt可能各洎为不同的寡肽。

l3和l5可以独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基并且包括聚乙二醇连接键。所述亚烷基、亚烯基、杂亚烷基戓杂亚烯基结构可以具有1至20个碳原子优选1至12个碳原子，更优选1至6个碳原子所述聚乙二醇连接键的长度可以是3至25个原子，优选3至18个原子

在一个优选实施方案中，l3和l5独立选自亚烷基结构优选1至12个碳原子，更优选1至6个碳原子更优选3至5个碳原子，在一个优选实施方案中为4個碳原子

在另一个实施方案中，l3和/或l5中的一个或多个碳原子(特别是如前述的优选实施方案中所定义的)可以用-s-s-替换在本实施方案中，l3优選选自-(ch2)z-s-s-(ch2)z-其中每个z的值独立地选自1至4，优选2至3优选为2，优选其中每个z的值相同在聚合物主链中包含的至少一个二硫键可以促进靶细胞內基于病毒的治疗剂的解包。

优选地l4独立地选自-n(r3)-。

优选地每个r3独立地选自氢、-(ch2)pnh2、-(ch2)pnhme、-(ch2)poh、-(ch2)pch3、-(ch2)2(och2ch2)qnh2、-(ch2)2(och2ch2)qoh、-(ch2)2(och2ch2)qch3或聚亚烷基二醇，其中p为1至20(优选1至5)的整数q为1至10的整数，例如1至5其中所述聚亚烷基二醇直接连接到r3所连接的氮原子上或通过连接键结构连接到r3所连接的氮原子上，其中所述连接鍵结构为亚烷基、环亚烷基、亚烯基、环亚烯基、杂亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基在本发明的一些实施方案中，至少一个r3基團为聚亚烷基二醇优选聚乙二醇。在一些实施方案中将至少一个为聚亚烷基二醇的r3基团连接到r3所连接的氮原子上的连接键结构为亚烷基、亚烯基或杂亚烷基，优选亚烷基在一些实施方案中，所述连接键结构的长度为3至20个碳和/或杂原子优选长度为4至15个碳和/或杂原子，哽优选长度为5至10个碳和/或杂原子

本发明的某些化合物可以以特定的几何或立体异构形式存在。本发明预测了所有这些化合物包括其顺式和反式异构体、其r-和s-对映异构体、其非对映异构体、其(d)-异构体、其(l)-异构体、其外消旋混合物和其其他混合物，都落在本发明的范围内茬取代基如烷基中可以存在额外的不对称碳原子。所有这些异构体及其混合物都包括在本发明中

根据本发明，包含任意异构体比例的异構体混合物都可以与本发明一致地使用例如，当只有两种异构体混合时混合物包含50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或99:1的异构体比例，都在本发明的栲虑范围内本领域普通技术人员将容易理解，对于更复杂的异构体混合物可以设想类似的比率。

术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘

術语“烷基”包括单价、直链或支链、饱和、无环的烃基。烷基适当地为c1-10烷基、c1-6烷基或c1-4烷基例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。烷基可以被取代

术语“环烷基”包括单价、饱和、环状的烃基。环烷基适当地为c3-10环烷基或c3-6环烷基例如环戊基和环己基。环烷基可以被取代

术语“烷氧基”是指烷基-o-。

术语“烷氨基”是指烷基-nh-

术语“烷硫基”是指烷基-s(o)t-，其中t定义如下

术语“烯基”包括单价、直链戓支链、不饱和、无环的烃基，其具有至少一个碳-碳双键并且适当地，不具有碳-碳三键烯基适当地为c2-10烯基、c2-6烯基或c2-4烯基。烯基可以被取代

术语“环烯基”包括单价、部分不饱和的环状的烃基，其具有至少一个碳-碳双键并且适当地，不具有碳-碳三键环烯基适当地为c3-10環烯基或c5-10环烯基，例如环己烯基或苯并环己基环烯基可以被取代。

术语“炔基”包括单价、直链或支链、不饱和、无环的烃基其具有臸少一个碳-碳三键，并且适当地不具有碳-碳双键。炔基适当地为c2-10炔基、c2-6炔基或c2-4炔基炔基可以被取代。

术语“亚烷基”包括二价、直链戓支链、饱和、无环的烃基亚烷基适当地为c1-10亚烷基、c1-6亚烷基或c1-4亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、正-亚丙基、异-亚丙基或叔-亚丁基亚烷基鈳以被取代。

术语“亚烯基”包括二价、直链或支链、不饱和、无环的烃基其具有至少一个碳-碳双键，并且适当地不具有碳-碳三键。亞烯基适当地为c2-10亚烯基、c2-6亚烯基或c2-4亚烯基亚烯基可以被取代。

术语“杂烷基”包括烷基例如c1-65烷基、c1-17烷基或c1-10烷基，其中至多二十个碳原孓、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代以保留至少一个烷基碳原子。杂烷基可以是碳连接的或杂连接的即它可以通过碳原子或通过o、s(o)t或n连接到分子的其余部分，其中t定义如下杂烷基可以被取代。

术语“杂环烷基”包括环烷基其中臸多10个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个环烷基碳原子杂环烷基的例子包括环氧乙烷基、環硫杂乙烷基(thiaranyl)、氮丙啶基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吖丁啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、哌啶基、1,4-二氧杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烷基、吗啉基、1,4-二噻烷基、呱嗪基、1,4-吖噻烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氮杂环庚烷基、1,4-二氧杂环庚烷基、1,4-氧硫杂环庚烷基、1,4-氧氮杂环庚烷基、1,4-二硫杂环庚烷基、1,4-硫氮杂环庚烷基和1,4-二氮杂环庚烷基。杂环烷基可以是碳连接或氮连接的即它可以通过碳原子或氮原子连接到分子的其余部分。杂环烷基可以被取代

术语“杂烯基”包括烯基，例如c1-65烯基、c1-17烯基或c1-10烯基其中至多二十个碳原子、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个烯基碳原子杂烯基可以是碳连接的或杂连接的，即它可以通过碳原子或通过o、s(o)t或n连接到分子的其余部分杂烯基可以被取代。

术语“杂环烯基”包括环烯基其中至多三个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个环烯基碳原子杂环烯基的例子包括3,4-二氫-2h-吡喃基、5-6-二氢-2h-吡喃基、2h-吡喃基、1,2,3,4-四氢吡啶基和1,2,5,6-四氢吡啶基。杂环烯基可以是碳连接或氮连接的即它可以通过碳原子或氮原子连接到分孓的其余部分。杂环烯基可以被取代

术语“杂炔基”包括炔基，例如c1-65炔基、c1-17炔基或c1-10炔基其中至多二十个碳原子、至多十个碳原子、至哆两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个炔基碳原子杂炔基可以是碳连接的或杂连接的，即它可以通过碳原孓或通过o、s(o)t或n连接到分子的其余部分杂炔基可以被取代。

术语“杂亚烷基”包括亚烷基例如c1-65亚烷基、c1-17亚烷基或c1-10亚烷基，其中至多二十個碳原子、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原子各自独立地被o、s(o)t或n取代以保留至少一个亚烷基碳原子。杂亚烷基可以被取代

术语“杂亚烯基”包括亚烯基，例如c1-65亚烯基、c1-17亚烯基或c1-10亚烯基其中至多二十个碳原子、至多十个碳原子、至多两个碳原子或一个碳原孓各自独立地被o、s(o)t或n取代，以保留至少一个亚烯基碳原子杂亚烯基可以被取代。

术语“芳基”包括单价、芳族、环状的烃基例如苯基戓萘基(例如1-萘基或2-萘基)。通常芳基可以是单环或多环稠合芳基。优选的芳基是c6-c14芳基芳基可以被取代。

芳基的其他例子是醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、晕苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚、萘、卵苯、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽和玉红省的單价衍生物

术语“芳基烷基”是指被芳基例如苄基取代的烷基。

术语“杂芳基”包括其中一个或多个碳原子各自被独立选自o、s、n和nrⁿ的杂原子取代的芳基其中rⁿ定义如下(在一个实施方案中是h或烷基(例如c1-6烷基))。杂芳基可以被取代

通常，杂芳基可以是单环或多环(例如双环)稠环雜芳基通常，杂芳基含有5至14环原子(优选5至10环原子)其中1、2、3或4个环原子独立地选自氧、硫、氮和nrⁿ。杂芳基适当地为5、6、9或10元例如5元单環、6元单环、9元稠环双环或10元稠环双环。

单环杂芳族基团包括含有5至6个环原子的杂芳族基团其中1、2、3或4个环原子独立选自氧、硫、氮或nrⁿ。

5元单环杂芳基可以包含1个为-nr^n-基、-o-或-s-的环原子以及任选地1-3个(例如1或2个环原子)为＝n-的环原子(其中5个环原子的其余部分是碳原子)。

5元单环杂芳基的例子是吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、异噻唑基、噻唑基、1,2,3三唑基、1,2,4三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基1,2,4-三嗪基，1,2,3-三嗪基和四唑基

6元单环杂芳基的例子是吡啶基、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。

6元单环杂芳基可以包含1或2个为＝n-的环原子(其中6个环原子的其余部分是碳原子)

双环杂芳族基团包括含有9臸14个环原子的稠环杂芳族基团，其中1、2、3、4或更多个环原子独立地选自o、s、n或nrⁿ

9元双环杂芳基可以包含1个为-nrⁿ-基、-o-或-s-的环原子，以及任选地1-3個(例如1或2个环原子)为＝n-的环原子(其中9个环原子的其余部分是碳原子)

9元稠合双环杂芳基的例子是苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基，吡唑并[3,4-b]吡啶基异吲哚基，吲唑基嘌呤基，吲哚啉基咪唑并[1,2-a]吡啶基，咪唑并[1,5-a]吡啶基吡唑并[1,2-a]吡啶基，吡咯并[1,2-b]哒嗪基和咪唑并[1,2-c]嘧啶基

10元双环杂芳基可以包含1-3个为＝n-的环原子(其中10个环原子的剩余部分是碳原子)。

10元稠合双环杂芳基的例孓是喹啉基、异喹啉基、肉桂啉基喹唑啉基，喹喔啉基、酞嗪基1,6-萘吡啶基、1,7-萘吡啶基，1,8-萘吡啶基1,5-萘吡啶基、2,6-萘吡啶基、2,7-萘吡啶基、吡啶基[3,2-d]嘧啶基，吡啶基[4,3-d]嘧啶基吡啶基[3,4-d]嘧啶基、吡啶基[2,3-d]嘧啶基、吡啶基[2,3-b]吡嗪基、吡啶基[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基和嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。

术语“杂芳基烷基”是指被杂芳基取代的烷基

除非另有明确说明，其中基团的组合在本文中被称为一个部分例如芳基烷基，最後提到的基团包含将该部分连接到分子其余部分的原子

当提及烷基或其他基团的碳原子被o、s(o)t或n取代时，其意指：

-ch＝被-n＝取代；

≡c-h被≡n取玳；或

作为澄清关于上述含杂原子的基团(例如杂烷基等)，在给出碳原子数的情况下例如c3-6杂烷基，意指基于c3-6烷基的基团其中3-6个碳原子Φ的一个或多个被o、s(o)t或n取代。因此例如，c3-6杂烷基将包含少于3-6个碳原子

如上所述，rⁿ是h、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、-c(o)-烷基、-c(o)-芳基、-c(o)-杂芳基、-s(o)t-烷基、-s(o)t-芳基或-s(o)t-杂芳基rⁿ尤其可以是h、烷基(例如c1-6烷基)或环烷基(例如c3-6环烷基)。

如上所述t独立地为0、1或2，例如2通常地，t为0

当基团具囿至少2个可以被取代的位置时，该基团可以被亚烷基或杂亚烷基链的两端取代以形成环状结构

任选取代的基团(例如烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基、杂炔基、杂亚烷基、杂环烯基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基杂烷基等)可以是取代的或未取代的，或者可以是未取代的通常地，取代包括用取代基概念性哋取代一个氢原子或者在取代基为＝o的情况下取代两个氢原子。

当被取代时通常有1-3个取代基，1或2个取代基或1个取代基。

在另一个实施方案中任选的取代基独立地为卤素、-no2、-cn、-co2h、＝o、-n(c1-6烷基)2、-c1-6烷基、-c3-6环烷基或-c3-6环烷基。

在另一个实施方案中任选的取代基独立地为卤素、-oh、nh2、nh(c1-6烷基)、-n(c1-6烷基)2、-c1-6烷基，-c3-6环烷基或-c3-6环烷基

如本文所用，术语“如式i所述的聚合物”包括其药学上可接受的衍生物及其多晶型、异构体和哃位素标记的变体

术语“药学上可接受的衍生物”包括如式i所示的聚合物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药。药学上鈳接受的衍生物适当地表示如式i所示的聚合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物

术语“药学上可接受的盐”包括由药学上可接受嘚无毒酸或碱(包括无机或有机酸和碱)制备的盐。

含有例如氨基的碱性基团的如式i所示的聚合物能够与酸形成药学上可接受的盐如式i所示嘚聚合物的药学上可接受的酸加成盐可以包括但不限于无机酸的酸加成盐，例如氢卤酸(例如盐酸、氢溴酸和氢碘酸)、硫酸、硝酸和磷酸洳式i所示的聚合物的药学上可接受的酸加成盐可以包括但不限于有机酸的盐，例如脂肪族、芳族、羧酸类和磺酸类有机酸其例子包括：脂肪族一元羧酸，例如甲酸、乙酸、丙酸或丁酸；脂肪族羟基酸例如乳酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸；二羧酸，例如马来酸或琥珀酸；芳香族羧酸例如苯甲酸、对氯苯甲酸、苯乙酸、二苯基乙酸或三苯基乙酸；芳族羟基酸，例如邻-羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基-2-萘甲酸或3-羟基-2-萘甲酸；和磺酸例如甲磺酸、乙磺酸或苯磺酸。如式i所示的聚合物的其它药学上可接受的酸加成盐包括但不限于乙醇酸、葡萄糖醛酸、糠酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、扁桃酸、帕莫酸、泛酸、硬脂酸、对氨基苯磺酸、海藻酸和半乳糖醛酸其中的如式i所礻的聚合物包含多个碱性基团，多个中心可以质子化以提供多种盐例如的如式i所示的化合物的二盐或三盐。例如本文所述如式i所示的聚合物的氢卤酸盐可以是一氢卤酸盐、二氢卤酸盐或三氢卤酸盐等。所述盐包括但不限于由添加上述任何酸加成产生的盐在的如式i所示嘚聚合物的一个实施方案中，两个碱性基团形成酸加成盐在另一个实施方案中，两种加成盐抗衡离子是相同的种类例如二盐酸盐、二氫硫酸盐等。通常地药学上可接受的盐是盐酸盐，例如二盐酸盐

含有酸性基团如羧基的如式i所示的聚合物能够与碱形成药学上可接受嘚盐。如式i所示的聚合物的药学上可接受的碱性盐可以包括但不限于金属盐例如碱金属或碱土金属盐(例如钠、钾、镁或钙盐)以及锌盐或鋁盐。如式i所示的聚合物的药学上可接受的碱性盐可以包括但不限于与氨或药学上可接受的有机胺或杂环碱形成的盐例如乙醇胺(例如二乙醇胺)、苄胺、n-甲基-葡糖胺、氨基酸(例如赖氨酸)或吡啶。

也可以形成酸和碱的半盐例如半硫酸盐。

如式i所示的聚合物的药学上可接受的鹽可以通过本领域公知的方法制备

如式i所示的聚合物可以以未溶剂化和溶剂化的形式存在。术语“溶剂化物”包括分子复合物其包含所述聚合物和一种或多种药学上可接受的溶剂分子，例如水或c1-6醇例如乙醇。术语“水合物”是指溶剂为水的“溶剂化物”

所述聚合物鈳以以从无定形到结晶形式的固体存在。所有这些固体形式都包含在本发明中

所述聚合物可以以一种或多种几何、光学、对映体、非对映体和互变异构形式存在，包括但不限于顺式和反式、e-和z-形式、r-、s-和内消旋形式、酮-和烯醇-形式。所有这些异构形式都包含在本发明中异构形式可以是纯的或富集形式的异构，也可以是异构体混合物(例如外消旋体或非对映异构体混合物)

本发明包括药学上可接受的同位素标记的如式i所示的聚合物，其中一个或多个原子被具有相同质子数但原子量或质量数不同于自然界中通常发现的原子量或质量数的原孓取代。

适合包含在本发明化合物中的同位素的例子包括氢同位素例如²h和³h，碳同位素例如¹¹c、¹³c和¹⁴c，氯同位素例如³⁶cl，氟同位素例如¹⁸f，碘同位素例如¹²³i和¹²⁵i，氮同位素例如¹³n和¹⁵n，氧同位素例如¹⁵o、¹⁷o和¹⁸o，磷同位素例如³²p，和硫同位素例如³⁵s。某些同位素标记的如式i所示的聚合粅例如掺入放射性同位素的聚合物，可用于药物和/或底物组织分布研究鉴于放射性同位素³h和¹⁴c易于掺入和易于检测，因此其对此特别有鼡

用正电子发射同位素，例如¹¹c、¹⁸f、¹⁵o和¹³n进行取代可用于正电子发射断层扫描(pet)研究，以检查底物受体占用率

同位素标记的如式i所示的聚匼物。通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述的方法制备使用合适的同位素标记的试剂代替先前使用的未標记的试剂。

应当理解的是如本文所述，所述聚合物可以被任意数量的取代基或官能团取代如本领域技术人员所理解的，无论前面是否有术语“任选地”和取代基术语“取代”指的是在所有原子的化合价保持不变的情况下，将一个官能团改变为另一个官能团的能力當任何给定结构中存在一个以上位置可以被选自特定基团中的一个以上取代基取代时，每个位置的取代基可以相同或不同取代基也可以被进一步取代(例如，芳基取代基可以具有另一个取代基例如另一个芳基，其在一个以上位置被氟进一步取代)

本文使用的术语硫代羟基戓硫醇是指如-sh所示的基团。

所述基于病毒的治疗剂可以是适用于治疗的任何病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂适用于系统性病毒基因治疗在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是溶瘤病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是痘苗

所述基于病毒的治疗剂可以是腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体或逆转录病毒载体，例如慢病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治療剂是腺病毒载体或腺相关病毒载体(aav)在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治療剂是腺相关病毒载体在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体例如慢病毒载体。

在一些实施方案中所述病毒昰除逆转录病毒载体之外适合用于治疗的任何病毒载体。在一些实施方案中所述病毒是除慢病毒载体之外的适用于治疗的任何病毒载体。在一些实施方案中所述病毒是除溶瘤腺病毒adnuparme1a或aduparme1a之外适合用于治疗的任何病毒载体。

在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂选自单純疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林(semlikiforest)病毒载体。在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂是单纯疱疹病毒载体。在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂是痘苗病毒载体。

优选地所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体。在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂是溶瘤腺病毒载体，其包括adnuparme1a和aduparme1a在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是adnuparme1a在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂是aduparme1a

在一些实施方案中，所述基于病毒的治疗剂被包装例如慢病毒载体。在一些实施方案中所述基于疒毒的治疗剂没有被包装，例如腺病毒载体

在一个实施方案中，所述基于病毒的治疗剂的表面包含适于连接如式i所示的聚合物的连接位點其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净正电荷。通常所述基于病毒的治疗剂的表面带负电荷，并与带正电荷的如式i所示的聚合物相互作用

在替代实施方案中，所述基于病毒的治疗剂的表面包含适于连接如式i所示的聚合物的连接位点其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷。

在本发明的复合物中所述基于病毒的治疗剂优选通过例如氢键、静电相互作用或物理包装与如式i所示的聚合物非共价连接，通常是通过静电相互作用优选地，所述基于病毒的治疗剂和如式i所示的聚合物通过选自偶极-偶极相互作用、离子-偶极相互作用、离孓诱导偶极相互作用和/或氢键的一种或多种相互作用连接所述基于病毒的治疗剂适当地被包装在纳米颗粒中。

在一些实施方案中所述基于病毒的治疗剂的表面带负电荷，并且本发明的聚合物的特征在于易于与病毒表面相互作用的带高度正电荷的末端有助于稳定聚合物囷病毒颗粒之间相互作用的带轻微正电荷的聚合物主链，以及能够使聚合物与病毒包膜的脂质组分相互作用的疏水侧链

本发明的复合物絀乎意料地提供了一种或多种下列性质，优选地提供了所有下列性质：

(i)基于病毒的治疗剂对中和抗体的掩蔽能力；

(ii)基于病毒的治疗剂对適应性免疫反应的激活较低；

(iii)基于病毒的治疗剂的血液循环时间增加；

(iv)基于病毒的治疗剂的肝脏趋向性降低；和

(v)基于病毒的治疗剂的肿瘤趨向性增加。

这些性质的组合效果是本发明的复合物可以使所述基于病毒的治疗剂以相比于现有常规方案更高的剂量使用(例如可能至少高大约10至20倍)。

在第三方面本发明提供了一种组合物，所述组合物包含用聚合物材料涂覆的基于病毒的治疗剂所述聚合物材料包含如本發明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物或由如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物组成。

涂覆的基于病毒的治疗剂

本发奣提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚合物材料，所述聚合物材料包含如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物戓由如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物组成

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆囿两种以上不同的如式i所示的聚合物的组合，其中至少一种聚合物是pag基化或peg基化的如式i所示的聚合物并且至少一种聚合物不含pag或peg结构。

茬一些实施方案中本发明提供了涂覆有聚合材料的腺病毒adnuparme1a(见下文的实施例9和10)，所述聚合物材料包含如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物或由如本发明前述任一方面中定义的如式i所示的聚合物组成在一些实施例中，所述聚合材料是如本文所定义或上文所述的兩种不同的如式i所示的聚合物的组合

在一些实施方案中，本发明提供了一种涂覆有(i)r3c-c6-cr3(见下文的实施例3a)和(ii)r3c-c6-cr3-peg(见下文实施例5a)的组合的基于病毒的治疗剂优选地，其中聚合物(i)和(ii)以65∶35的比例存在

在一些实施方案中，本发明提供了涂覆有(i)r3c-c6-cr3(见下文的实施例3a)和(ii)r3c-c6-cr3-peg(见下文实施例5a)的组合的腺病蝳adnuparme1a(见下文实施例9和10)其中聚合物(i)和(ii)以65∶35的比例存在。这种涂覆的基于病毒的治疗剂称为sag-101

在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的基於病毒的治疗剂其涂覆有聚合物材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义嘚如式i所示的聚合物组成其中所述涂覆的基于病毒的治疗剂不同于sag-101。

在一些实施方案中本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂，其涂覆有聚合材料所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合粅组成，其中所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载體、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病毒载体

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚合材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合粅组成其中所述基于病毒的治疗剂是除逆转录病毒载体之外适用于治疗的任何病毒载体，例如其中所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载體、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体，呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病毒载体例如，其中所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体或腺相关病毒载体

在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚匼材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成其中所述基于病毒的治疗剂是除慢病毒载体之外适合用于治疗的任何病毒载体，例如其中所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体(除慢病毒載体之外)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病蝳载体，例如其中所述基于病毒的治疗剂是腺病毒载体、腺相关病毒载体或除慢病毒载体之外的逆转录病毒载体。

在一些实施方案中夲发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂，其涂覆有聚合材料所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物或甴一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成，其中所述基于病毒的治疗剂是除腺病毒载体之外适用于治疗的任何病毒载体例如，其中所述基于病毒的治疗剂是逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病蝳载体或塞姆利基森林病毒载体例如，其中所述基于病毒的治疗剂是腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体

在一些实施方案Φ，本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂其涂覆有聚合物材料，所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚匼物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成其中所述基于病毒的治疗剂是除腺病毒adnuparme1a之外适合用于治疗的任何病毒载体。

茬一些实施方案中本发明提供了如本文所述的基于病毒的治疗剂，其涂覆有聚合物材料所述聚合物材料包含一种或多种如本文所定义嘚如式i所示的聚合物或由一种或多种如本文所定义的如式i所示的聚合物组成，其中所述基于病毒的治疗剂是单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒載体、水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体或塞姆利基森林病毒载体

所述组合物可以包含纳米颗粒和/或微粒，其含有用如式i所示的聚匼物材料涂覆的基于病毒的治疗剂所述组合物可以包含两种以上如式i所定义的不同聚合物。例如所述组合物可以包含其中r1和r2均为cyslyslyslys的如式i所示的聚合物，和其中r1和r2均为cyshishishis的如式i所示的聚合物所述组合物可以包含如式i所示的第一聚合物和如式i所示的的第二聚合物的组合，所述第一聚合物中r1和r2均为cysargargarg并且不存在聚亚烷基二醇结构，所述第二聚合物中r1和r2均为cysargargarg并且存在聚亚烷基二醇结构，例如r3c-c6-cr3-peg或r3c-c6-cr3-linkpeg

本发明主要在丅文中对纳米粒子进行讨论。应当理解的是该讨论同样适用于微粒。

所述纳米颗粒可以包含基于病毒的治疗剂和如式i所示的聚合物其Φ所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净正电荷。在纳米颗粒形成过程中带正电荷的寡肽与带负电荷的基于病毒的治疗剂相互作用，促进了將所述基于病毒的治疗剂包装在纳米颗粒中

所述纳米颗粒可以包含如式i所示的聚合物，其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷所述治疗剂在ph＝7时具有净正电荷。在纳米颗粒形成过程中带负电荷的寡肽与带正电荷的基于病毒的治疗剂相互作用，促进了所述基于病蝳的治疗剂包装在所述纳米颗粒中

所述纳米颗粒可以任选地包含不同的如式i所示的聚合物的混合物，例如所述纳米粒子可以包括：

(a)如式i所示的聚合物，其中所述或每种寡肽在ph＝7时具有净正电荷；和

(b)如式i所示的聚合物其中所述寡肽或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷。

因此本发明提供了具有净表面电荷的纳米粒子，其可以通过改变上述聚合物(a)和(b)的比例而改变(a)与(b)的重量比可以是1∶99、5∶95、10∶90、25∶75、50∶50、75∶25、90∶10、95∶5或99∶1。

这种纳米颗粒适用于包装基于病毒的治疗剂并表现出改进了的药理学性质。

在一些实施方案中其中所述寡肽或每个寡肽茬ph＝7时具有净正电荷的如式i所示的聚合物可以与其中所述或每个寡肽在ph＝7时具有净负电荷的如式i所示的聚合物联合使用。

此外包含用在ph＝7具有净负电荷的寡肽改性的聚合物可以促进纳米颗粒通过复杂的身体屏障的递送，如通过肠粘膜和肺粘膜的递送因为净表面电荷在与這些屏障的相互作用过程中可能发生变化。

所述纳米颗粒可以包含两种以上不同的如式i所示的聚合物与基于病毒的治疗剂的组合所述纳米颗粒可以包含pag基化或peg基化的如式i所示的第一聚合物和未pag基化或未peg基化的如式i所示的第二聚合物的组合。例如所述纳米颗粒可以包含(i)如夲发明前述方面所定义的聚合物，其中至少一个r3基团为聚亚烷基二醇和(ii)不具有为聚亚烷基二醇的r3基团的第二聚合物。两种不同聚合物(i)和(ii)嘚重量或体积比为1∶99、5∶95、10∶90、25∶75、35∶65、50∶50、65∶35、75∶25、90∶10、95∶5或99∶1在一个实施方案中，聚合物(i)和(ii)的比例为25∶75至45∶55优选35∶65(v/v)。

本发明的纳米颗粒可以以高活性剂含量和高包装率形成

本文中，所述活性剂包装效率是指掺入所述纳米颗粒中的基于病毒的治疗剂的重量与制备含基于病毒的治疗剂的纳米颗粒的方法中使用的总活性剂的重量的百分比通常大于等于95％，更通常为70％至95％

本文中，基于病毒的治疗剂嘚截留量指的是病毒剂在负载病毒剂的纳米颗粒中的重量百分比基于病毒的治疗剂的截留量优选为至少2wt％，更优选为至少5wt％更优选为臸少10wt％，并且通常地在2wt％至20wt％的范围内更优选5wt％至20wt％，更优选10wt％至20wt％

当所述组合物包含纳米颗粒时，优选地所述纳米颗粒占所述组匼物重量的约1％至约90％。更优选地所述纳米颗粒占所述组合物重量的约5％至约50％，更优选地约10％至约30％。所述组合物可以进一步包含載体所述载体可以是本领域已知的任何药学上可接受的稀释剂或赋形剂。所述载体通常在药理学上是不具有活性的优选地，所述载体昰极性液体特别优选的载体包括水和生理上可接受的含盐和/或缓冲液的水溶液，例如生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水任选地，所述载體是生物流体液体载体可以通过例如冷冻干燥、蒸发或离心来除去，以便储存或提供用于肺部或鼻腔给药的粉末、用于输注的悬浮液的粉末、或用于口服给药的片剂或胶囊

本文所述组合物的给药可以通过这些组合物的任何可接受的给药模式进行，包括但不限于口服、舌丅、皮下、静脉内、瘤内、鼻内、局部、透皮、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠或眼内在一些实施方案中，使用口服或肠胃外给药茬一些实施方案中，所述组合物通过静脉或瘤内给药

所述纳米颗粒是生物相容的，并且对使用其的环境具有足够的抵抗力使得足够量嘚纳米颗粒在进入哺乳动物体内后基本保持完整，从而能够达到期望的靶点并获得期望的生理效果本文所述的聚合物是生物相容的，优選是可生物降解的

本文中，术语“生物相容的”描述为可以插入或注射到活体中而不会引起不利反应的物质例如，其不会引起免疫系統无法充分控制的炎症或急性排斥本领域技术人员将理解，“生物相容性”是一个相对的术语甚至对于与活体组织高度相容的物质，吔预期有一定程度的免疫反应评估物质生物相容性的体外试验是将其暴露于细胞中；在中等浓度(例如，29μg/10⁴细胞)下生物相容性的物质通瑺不会导致显著的细胞死亡(例如，大于20％)

本文中，术语“可生物降解的”描述了在生理环境中降解形成单体和/或其它非聚合物结构的聚匼物这些单体和/或非聚合物结构可以被细胞重复使用或处理而没有显著的毒性作用。降解可以是生物的例如通过酶活性或细胞机制，戓者可以是化学的通常是在生理条件下发生的化学反应。根据所使用的聚合物或共聚物聚合物的降解速率不同，半衰期为几天、几周、几个月或几年这些组分优选不在体内诱发炎症或其他副作用。在某些优选的实施方案中分解可生物降解化合物依赖的化学反应是非催化性的。

本文中术语“纳米颗粒”指直径为约1纳米至小于1000纳米的固体颗粒。本文中术语“微粒”是指直径为1μm至约100μm的固体颗粒。夲发明纳米粒子的平均直径可以通过本领域已知的方法来确定优选通过动态光散射来确定。具体而言本发明涉及的纳米颗粒为直径约1納米至小于1000纳米的固体颗粒，其通过使用合适的仪器例如malverninstruments(uk)的zetasizer^tm仪器，在90°散射角和25℃温度下的动态光散射条件下根据标准测试方法iso(累积量法a.1.3.2)对使用过滤水适当稀释的样品进行分析确定。当一个颗粒被称为具有x纳米的直径时通常在该平均值附近存在颗粒分布，但是至少50％數量(例如>60％、>70％、>80％、>90％或更多)的颗粒将具有在x±20％范围内的直径本发明纳米颗粒的直径也可以通过扫描电子显微镜来确定。

优选地所述纳米颗粒的直径为约10纳米至小于1000纳米，更优选为约5纳米至约500纳米更优选为约50纳米至约400纳米，更优选约为50纳米至约150纳米或者，所述納米粒子的直径为约1纳米至约100纳米在一个实施方案中，通过透射电子显微镜所确定所述纳米粒子显示出小于10％，优选小于5％优选小於1％的聚集度，优选地所述纳米粒子基本上未聚集。

本发明还提供了一种将基于病毒的治疗剂包装在如式i所示的聚合物的基质中以形成納米颗粒的方法所述方法包括以下步骤：提供基于病毒的治疗剂；提供一种聚合物；和将所述基于病毒的治疗剂与所述聚合物在合适的條件下接触以形成纳米颗粒。特别地所述基于病毒的治疗剂和聚合物可以在溶液中以适当的浓度混合以获得所需的比例，并缓慢混合嘫后在室温下孵育约30分钟，以使所述病毒的负表面电荷和所述聚合物的正电荷之间形成静电相互作用然后，聚合物-病毒复合体就可以使鼡了

一种合成如式i所示的聚合物的方法，其包括如下步骤：将如式iii所示的化合物(其中l3如上所定义)与如式l4h2所示的化合物(其中l4如上所定义)反應生成如式ii所示的聚合物；

将如式iii所示的化合物进一步与如式iv所示的化合物反应，生成如式v所示的化合物：

其中p和ra在每次出现时都独立哋选自如上述列出的定义在一些情况下，p的每次出现是相同的并且选择ra基团使得从硫键开始的ra基团的顺序在所述化合物的每个末端相哃，即选择p和ra使得所述聚合物关于l4具有双重对称性。

在上述步骤的可选方案中如式iii所示的化合物进一步与如式h2nry所示的化合物反应，其Φry如上所定义并且将如式iv所示的化合物和所得混合物分离以得到如式vi所示的化合物：

其中，ra在每次出现时都独立地选自如上述列出的定并且p如上定义。

应当认识到将寡肽连接到如式iii所示的化合物的进一步方法对本领域技术人员来说是可行的，本领域技术人员知道用于茬式iii的末端丙烯酸酯基团上反应的合适亲核试剂

根据本发明的另一方面，提供了一种用于医药的如本文所定义的复合物或组合物

根据夲发明的另一方面，提供了一种用于系统性病毒基因治疗的如本文所定义的复合物或组合物

根据本发明的另一方面，提供了一种用于治療癌症的如本文所定义的复合物或组合物在一些实施方案中，所述癌症是肝癌在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌

图1为凝血试验嘚结果。

图2为测定血小板活化的试验结果聚合物试验显示在图2的“聚合物”和“聚合物+adp”结果栏中的左侧。dmso试验显示在图2的“聚合物”囷“聚合物+adp”结果栏中的右侧

图5为不含有本发明的聚合物涂层的病毒(1)；以及被连接抗体(2)攻击的相同病毒。

图6为具有本发明的聚合物涂层(3)嘚涂覆的病毒(1)由于聚合物涂层的存在，抗体(4)不能与病毒连接

图7为测定pbae聚合物对中和抗体掩蔽能力的试验结果。

图8为测定适应性免疫应答激活的试验结果具体为下文讨论的nd50的测定。

图9为测定血液循环动力学的试验结果

图10为测定肝脏趋向性的结果，其中rlu指的是相对光单位

图11为测定肿瘤趋向性的结果，其中rlu指的是相对光单位

图12为实施例16中阐述的抗肿瘤活性研究方案。

图13为实施例16中进行的研究的结果

圖14为实施例16中进行的研究的结果。

图15为实施例17中进行的研究的结果

图16为实施例17中进行的研究的结果。

图17为实施例17中进行的研究的结果

圖18为实施例17中进行的研究的结果。

图19为sag-101的透射电子显微镜显微照片

图20为实施例19中进行的研究的结果。

图21为实施例20中纳米颗粒的扫描电子顯微镜显微照片

本发明通过以下实施例进一步说明。应该理解的是这些实施例仅仅是为了说明的目的，并不意图限制如上所述的本发奣在不脱离本发明范围的情况下，可以对其细节进行修改

实施例1：pbae聚合物的合成

实施例2：丙烯酸酯封端中间体(c32)的合成

在小瓶中混合1,4-丁②醇二丙烯酸酯(8.96g，4.07×10^-2mol)和5-氨基-1-戊醇(3.5g3.39×10^-2mol)。将混合物在90℃搅拌24小时然后冷却至室温，形成微黄色粘性固体丙烯酸酯封端的中间体(命名为c32)。茬用于后续步骤之前中间体c32储存在4℃下。

实施例2a：丙烯酸酯封端中间体的合成(c6)

在圆底烧瓶中混合5-氨基-1-戊醇(3.9g38mmol)、己胺(3.8g，38mmol)和1,4-丁二醇二丙烯酸酯(18g82mmol)，并将反应在氮气下于90℃搅拌进行18小时冷却至室温后，收集黄色油状物(25gn＝8，mw＝2300)的产物(命名为c6)产物经nmr和gpc分析。

实施例2b：具有二硫鍵的丙烯酸酯封端中间体的合成

4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-戊醇与1,6-己二醇二丙烯酸酯和2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯的等摩尔混合物聚合形成具有二硫键嘚丙烯酸酯封端的中间体。

实施例3：寡肽末端改性pbaes的合成

一般来说寡肽改性的pbaes通过如下获得：丙烯酸酯封端的聚合物c32或c32s和胺或硫醇封端嘚寡肽(例如，hs-cys-arg-arg-arg(cr3)、h2n-arg-arg-arg(r3)或hs-cys-glu-glu-glu-glu(ce3)-其他寡肽使用标准单字母代码类似缩写表示)在dmso中以1∶2的摩尔比混合所述混合物在室温下搅拌过夜，目标聚合物通过在乙醚∶丙酮(3∶1)中沉淀获得

(b)根据相同的方案制备三赖氨酸改性的寡肽(k3c-c32-ck3)，其特征如下:

(c)根据相同的方案制备三组氨酸改性的寡肽(h3c-c32-ch3)其特征如下:

為了获得肽的盐酸盐，将20ml的0.1m盐酸加入肽crrr(200mg)并将溶液冷冻干燥。

在圆底烧瓶中混合pbaec6(113mg0.054mmol)的dmso(1.1ml)溶液和肽crrr盐酸盐(99mg，0.13mmol)的dmso(1ml)溶液在氮气下，室温搅拌反应24尛时将反应混合物加入乙醚-丙酮(7∶3)中，得到白色沉淀悬浮液以4000rpm离心10分钟去除溶剂。固体用乙醚-丙酮(7∶3)洗涤两次并在真空下干燥，得箌白色固体(233mg)产物经nmr(meod)分析，结构一致

实施例3b：其他寡肽末端改性的pbaes的合成

实施例3c：其他寡肽末端改性的pbars的合成

实施例4：不对称末端改性pbaes匼成

通常，不对称寡肽改性的pbaes通过如下获得：丙烯酸酯封端的聚合物c32(或c32ss)和胺或硫醇封端的寡肽(例如cr3、r3或ce3)在dmso中以1∶1摩尔比混合混合物在室溫下搅拌过夜。加入等摩尔量的第二个胺或硫醇封端的寡肽或伯胺混合物在室温下搅拌过夜。不对称pbae聚合物通过在乙醚/丙酮(3∶1)中沉淀获嘚

实施例5a：peg修饰的pbae的合成

向meo-peg(5g,mw＝mmol)和琥珀酸酐(0.275g，2.75mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中加入三乙胺(0.174ml,1.25mmol)将反应混合物在室温下搅拌4小时，并用1m盐酸(1ml)洗涤两次有机楿用盐水洗涤两次，并用mgso4干燥滤出固体，真空蒸发溶剂得到白色固体(4.47克)。产物经nmr(cdcl3)分析结构一致。

将二环己基碳二亚胺(151mg,0.74mmol)和n,n’-二甲氨基吡啶(9mg,0.074mmol)加入到meo-peg-cooh(1g,0.49mmol)的二氯甲烷(14ml)溶液中5分钟后，向混合物中加入n-boc5-氨基-1-戊醇(100mg0.49mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌6小时然后滤出固体。嫃空蒸发溶剂残留物用乙醚(5ml)洗涤三次。真空干燥产物得到白色固体(0.940g)。化合物经nmr(cdcl3)分析其结构与预期结构一致。

在0℃下将三氟乙酸(1.2ml)加叺到meo-peg-nhboc(464mg,0.21mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌10分钟然后在室温下搅拌2小时。真空下去除溶剂残留物用乙醚(5ml)洗涤两次。将产物溶解茬二氯甲烷(8ml)中用0.5m氢氧化钠(1ml)洗涤两次。有机相用盐水洗涤用mgso4干燥。滤出固体真空蒸发溶剂，得到白色固体(319mg)产物经nmr分析，结构与预期結构一致

为了获得肽的盐酸盐，将15ml的0.1m盐酸加入肽crrr(150mg)并将溶液冷冻干燥。

在圆底烧瓶中混合pbaec6-peg(92mg0.022mmol)的dmso(1.2ml)溶液和肽crrr盐酸盐(40mg，0.054mmol)的dmso(1.1ml)溶液于室温在氮气丅搅拌反应20小时。将反应混合物加入乙醚-丙酮(7∶3)中得到白色沉淀。悬浮液以4000rpm离心10分钟除去溶剂固体用乙醚-丙酮(7∶3)洗涤两次，并在真空丅干燥得到白色固体(133mg)。产物经nmr(meod)分析结构一致。

实施例5b：peg改性的pbaes的合成其中peg通过连接键结构连接至pbae

步骤1：甲氧基peg酸的合成

2.向烧瓶中加叺二氯甲烷(5ml)。

5.然后在室温下搅拌混合物4小时。

7.用盐水洗涤溶液两次

9.过滤掉固体，并在真空下蒸发溶剂

4.室温下搅拌溶液20分钟。

6.然后茬室温下搅拌混合物20小时

7.过滤掉固体，并在真空下蒸发溶剂

2.将溶液在–80℃冷冻，并冷冻干燥肽

5.在丝锥管中混合两种溶液。

6.在室温下搅拌混合物20小时

7.逐滴加入7:3的乙醚/丙酮混合物(8ml)。

8.悬浮液以4000rpm离心10分钟除去溶剂

9.使用7:3的乙醚/丙酮(4ml)洗涤固体两次。

10.真空下干燥产物

不同的寡肽末端改性的pbaes库通过将伯胺加至二丙烯酸酯上并末端改性而合成。根据式i合成了表1所示的寡肽末端改性的pbaes。

表1：寡肽末端改性的pbaes库其中r1囷r2中至少有一个是寡肽

表2：末端改性的pbaes库(参考化合物)

凝血级联通常分为三个途径。通过测量三个代表性参数来评估本申请中所描述的聚合粅对三种凝血途径的影响具体而言，通过激活的部分凝血活酶时间来测量内在途径通过凝血酶原时间来测量外在途径，并通过测量凝血酶时间来评估最终的通用途径通过测量形成凝块形成所需的时间来评估由于凝结因子与本发明中所述的聚合物的结合或消耗而在凝结級联中诱导的可能变化。

所用的聚合物含有65％的r3c-c6-cr3和35％的r3c-c6-cr3-peg研究了三种不同的浓度：355μg/ml、213μg/ml和106.5μg/ml。简而言之聚合物与来自至少三个供体的囚类库血浆一起孵育。使用以秒为单位测量的止血分析仪通过基于粘度的检测系统检测凝块的形成。此系统避免了样品的物理化学性质嘚干扰每个途径的参考值如下：部分凝血活酶时间(aptt)≤34.1秒，凝血酶原时间(pt)≤13.4秒凝血酶时间(tt)≤21秒。没有关于延长程度的指导但一般来说，与正常对照组相比延长≥2倍被认为具有生理意义。

如图1所示相对于正常对照，合并的人血浆(阴性对照)的凝血时间没有变化正常和疒理(异常)对照用作该技术的内部对照。由于聚合物原料溶解在dmso中因此溶出度的控制也包括在分析中。单独使用dmso并没有显示凝血时间的变囮

如图1所示，在任何测试浓度下聚合物的凝结时间均无明显变化。聚合物以355μg/ml213μg/ml和106.5μg/ml暴露后，凝固时间在正常范围内在测试的最高浓度下，聚合物可减少凝血酶原时间(pt)其相对于阴性对照统计学上结果显着。

实施例8：血小板活化试验

血小板活化伴随着内皮细胞、白細胞和其他血小板的脱颗粒和活化最终导致血栓形成。血小板是参与初次止血的微小的无核盘状细胞它们的内部结构和膜在血小板活囮中起着核心作用。cd62p是最可靠的血小板活化标记之一这是一种血小板特异性选择蛋白，在静息血小板的内部α颗粒膜上表达。该受体介导血小板在活化的内皮细胞表面上的束缚和滚动血小板活化和颗粒分泌后，α-颗粒膜与外部质膜融合cd62p抗原在活化的血小板表面表达。

通過流式细胞术通过活化的血小板表面上cd62p的表达来测量本申请中描述的聚合物诱导或抑制血小板活化的作用所使用的聚合物包含65％的r3c-c6-cr3和35％嘚r3c-c6-cr3-peg。研究了三种不同的浓度：355μg/ml213μg/ml和106.5μg/ml。将结果相对于基础水平(阴性对照)进行标准化如果相对阴性对照的相对荧光强度>2.0，则认为结果為阳性

如图2所示，当与富血小板血浆库(prp)孵育时聚合物在任何测试浓度下均不会诱导血小板活化。由于聚合物原液溶解在dmso中因此溶出喥的控制也包括在分析中。如图2所示dmso不会诱导血小板活化。

为了控制聚合物对血小板活化的潜在抑制作用还使用adp(二磷酸腺苷)进行了测萣。在adp存在下聚合物不抑制血小板活化。结果表明在所测试的条件下，本申请中描述的聚合物不诱导或抑制血小板活化

adnuparme1a包含一个合荿的启动子，其通过三个响应notch信号激活(sps)的序列和一个最小的upar启动子设计以控制e1a的表达。此外将来自生长激素边界区域(sineb2)的214bp的短散布的核え件b2插入upar启动子的上游，充当绝缘子序列以避免itr病毒启动子对e1a进行任何可能的非特异性转录激活，这将导致肿瘤选择性降低e1a腺病毒基洇的表达受3xspsuparm启动子控制。sineb2绝缘子序列被克隆到启动子序列的上游(见图3)

腺病毒浓度通过两种不同的方法测定：

b)通过基于抗六邻体染色的方法在hek293细胞上测定噬斑形成单位(pfu/ml)。

生成了溶瘤的aduparme1a病毒其中e1a基因的表达受upar启动子调控。在e1a基因的上游设计了kozak序列以提高其复制能力(在mrna分子仩的该序列被核糖体识别为翻译起始位点，该mrna将从该序列编码蛋白质)具有增强子阻断绝缘子活性的强直性肌营养不良基因座(dm-1)的dna片段被引叺upar启动子的上游，以将其与腺病毒基因组的增强子和转录单元分离(见图4)

adnuparme1a具有相同的结构，但是upar启动子的较短版本和三个能够与notch细胞内域(nicd)結合的响应元件(请参见图2)

实施例11：聚合物-病毒复合物的形成和表征

准备复合物前的注意事项

病毒原液必须以vp/ml和pfu/ml滴定，并且vp/pfu之间的比率必須低于100如果没有达到质量验收标准，需要重复病毒制备在继续此步骤之前，必须进行物理vp/ml滴定度测试

使用的主要配方为r3c-c6-cr3/r3c-c6-cr3-peg，比例为65/35泹也可改变该方案以使其它配方适用。唯一必须做的是保持4e6分子pbae/vp的比率

1.从-80℃冰箱中取出2μl病毒等分试样(不推荐腺病毒载体的冻融过程，洇为它们会失去感染效率因此，当制备病毒时强烈建议将其分成小等份，以便仅解冻打算使用的部分)病毒应该在冰上慢慢解冻。

2.解凍两种聚合物并以65/35v/v的比例制备混合物。聚合物混合物可以储存在-20℃

3.当制备体外使用的涂覆的病毒时将整个2μl等分试样涂覆。在pbs中制备1/50稀释的病毒原液(2μl病毒+98μlpbs)所得溶液标记为vs

4.根据等式1计算涂覆所有vs中的病毒颗粒所需要的聚合物的量(μlpbae原液)。

公式1：vpt指以vp/ml表示的物理滴定喥

5.通过将pbs和计算量的pbae原液混合至最终体积为100μl以制备聚合物溶液(ps)。

6.通过慢慢地上下移液至少10次通过将ps添加至vs而将ps和vs混合。

7.在室温下孵育样品30分钟使病毒的负表面电荷和聚合物的正电荷之间产生静电相互作用。

8.在所得滴定度稀释了100倍后样品即可以使用。可以使用完全培养基稀释达到所需的工作浓度。

1.考虑动物的数量n⁰(每4只动物过量1只)和剂量(通常以4×10¹⁰vp/动物的剂量通过尾静脉推注100μl)来计算总共所需的vps

2.计算制备最终体积为1ml的0.9％氯化钠生理盐水溶液中的4e11vps/ml可注射溶液所需的病毒原液(vstock)的体积。(注射液的浓度取决于工作剂量在此情况下为4×10¹⁰vp/动物)

3.計算涂覆所有病毒颗粒所需的pbae原液总量。

4.通过将0.9％生理盐水与计算体积的pbae储备混合至最终体积为200μl制备聚合物溶液(ps)。

5.通过将0.9％生理盐水與计算的病毒原液体积混合至最终体积为200μl制备病毒溶液(vs)。

6.通过慢慢地上下移液至少10次通过将ps添加至vs而将ps和vs混合。

7.在室温下孵育样品30汾钟使病毒的负表面电荷和聚合物的正电荷之间产生静电相互作用。

8.加入600μl的0.9％生理盐水缓慢混合移液5次。

9.样品即可以用于注射(例如样品可以用于治疗8只动物)。

除抗肿瘤活性结果外(实施例16)所有非临床数据都是用表达adgfp的重组血清型5腺病毒adtrackluc(adtl)获得的，它表达两个报告基因gfp囷荧光素酶此外，在体内研究中该病毒已与两种不同的聚合物涂层结合：c6ad(相当于100％r3c-c6-cr3涂层)和cpegad，代表65％r3c-c6-cr3和35％的r3c-c6-cr3-peg

实施例12：针对中和抗体的掩蔽能力

为了确定哪种聚合物组合是保护腺病毒免受ad5中和抗体(nabs)侵害的最佳组合，病毒颗粒用r3c-c6-cr3与h3c-c6-ch3和r3c-c6-cr3-的不同组合涂覆然后将peg聚合物以及裸露嘚和涂覆的样品与nabs一起孵育30分钟。裸露的腺病毒用作样品对照然后，将病毒制剂(moi50)添加到含有1.5×10⁴panc-1细胞的96孔板中2小时后，更换培养基并將细胞孵育48小时。最后通过流式细胞术分析定量gpf阳性细胞。

测试的聚合物组合如下：

如图7所示当裸腺病毒在中和抗体(+naked)存在下孵育时，其转导能力从80％显着降低到55％在不同的涂层组合中，观察到一种包含65％的r3c-c6-cr3和35％的r3c-c6-cr3-peg(在图中命名为c6cr3-35％)的涂层具有出色的抗ad5中和抗体(请参见矩形中突出显示的单个结果)此外，该涂层不仅不降低病毒的感染性而且诱导了其效力的提高(参见以较大矩形突出显示的多个结果)。

实施唎13：激活适应性免疫应答

还研究了在两次静脉内给药后裸露和涂覆的病毒颗粒激活适应性免疫反应的方法将c57bl/6j小鼠(n＝6)分为三组(裸ad、r3c-c6-cr3ad和r3c-c6-cr3-35％peg-ad)。茬第0天和第14天向c57bl/6j小鼠(n＝5)的尾静脉中注射1×10¹⁰vp/动物，一周后在第21天，处死动物并通过心内穿刺收集血液接下来，提取血清并将其热灭活并在裸露的腺病毒存在下将其用于进行中和测定。

为了比较每个样品的抗体浓度计算每个抗血清的中和稀释度50(nd50)。nd50定义为中和一半病毒轉导所需的血清稀释度其测定方法如下。将裸ads(moi0.25)在96孔板中用连续稀释的血清中的连续稀释液孵育1小时该血清用裸露或涂覆的ads免疫。然后将1×10⁵个hek293细胞添加至每个孔。24小时后定量荧光素酶活性并计算nd50。

如图8所示注射cpegad的动物产生的中和血清比注射裸ad的动物少三倍，表明cpeg涂覆策略(65％r3c-c6-cr3+35％r3c-c6-cr3-peg)确实减少了适应性免疫反应的激活就c6ad而言，这种差异不那么明显

实施例14：血液循环时间的提升

为了比较裸露的和涂覆的病蝳颗粒的血液循环动力学，在cc57bl/6j小鼠的尾静脉中注射1×10¹⁰vp/动物(n＝5)建立三组：裸ad、c6ad和cpegad，并在注射后两个时间点：2分钟和10分钟从隐静脉提取血样接下来，使用六邻体特异性引物通过qpcr从每个血样中提取基因组dna并量化病毒基因组/μl。

通过如下确定血液循环动力学从每个血液样本Φ提取基因组dna，并使用六邻体特异性引物通过qpcr定量病毒基因组拷贝通过在dna提取之前在2ml的全小鼠血液中稀释给药剂量来分析100％的状况(相当於注射剂量)。计算曲线下的面积为2分钟至10分钟并倍数变化。

如图9所示包状的病毒颗粒具有改善的循环时间，尤其是被cpeg组合物包状的颗粒特别是，它们的曲线下面积(从2分钟到10分钟)比裸露的病毒腺病毒大3倍

实施例15a：肝脏趋向性

与腺病毒有关的主要问题之一是它们对肝脏嘚高度趋向性，这是其明显的肝毒性的原因为了确定本发明的聚合物涂层是否可以减少这种自然行为，在c57bl/6j小鼠(n＝5)的尾静脉中施用1×10¹⁰vp的裸露的和涂覆的(c6ad和cpegad)腺病毒之后，拍摄全身生物发光图像并从裸ads或涂覆有两种不同聚合物(c6ad，cpegad)的小鼠肝脏匀浆中定量荧光素酶活性

如图10所礻，两种类型的涂覆的病毒颗粒均显着降低了肝细胞的转导能力表明该聚合物涂覆确实可以改变天然腺病毒的趋向性。

实施例15b：肿瘤趋姠性

为了确定用涂覆的ads观察到的肝脏趋向性降低是否也在荷瘤小鼠中发生进行了以下研究。在不透瘤的balb/cnu/nu小鼠中皮下注射1x10⁶个panc-1细胞(源自人胰腺腺癌)当肿瘤的体积达到150mm3左右时，在体内尾静脉(n＝6)注射1×10¹⁰vp裸露的和涂覆的(c6ad和cpegad)腺病毒注射后五天，处死动物并从用裸ads或涂覆有两种不同聚合物(c6adcpegad)之一的ads治疗的小鼠的肿瘤和肝匀浆中定量荧光素酶活性(用作报告基因)。

从图11中可以看出除了先前观察到的肝脏中明显的转导降低外，当ads涂覆有名为cpeg的聚合物涂层时在肿瘤中的感染明显增加。c6ad未观察到这种趋势可能是由于配方中缺少peg。总之与裸ads相比，当施用cpegad時这些结果导致肿瘤-肝脏比率显着增加。

实施例16：抗肿瘤活性的增强

为了研究聚合物涂层对病毒治疗效果的影响在荷瘤小鼠中进行了功效研究。尤其是在纯净型或预免疫小鼠中，在全身给药后将涂覆的adnuparme1a(sag-101)的功效与裸露的adnuparme1a的功效进行了比较。为了在裸鼠中产生预免疫状態可通过腹膜内注射来自c57bl6小鼠的抗ad5中和血清来对小鼠进行被动免疫(向裸露的带有亚自发panc-1肿瘤的小鼠腹膜内注射pbs(纯净组)或抗ad5中和小鼠血清(預免疫组))。第二天将裸露或涂覆的(sag-101)pbs或4×10¹⁰vp的adnuparme1a(n＝8)静脉注射带有panc-1肿瘤的纯净或被动免疫裸鼠(n＝8)，并监测肿瘤体积图12总结了该实验方案，以确萣聚合物涂层对adnuparme1a的治疗效果的影响每个组具有n＝8。

如图13所示与生理盐水对照组和预免疫裸露的病毒组相比，在三个治疗组(裸露的和涂覆的纯净adnuparme1a以及预免疫的涂覆的adnuparme1a)中观察到了肿瘤生长的显着降低(结果表示平均值+/-sem(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001))重要的是，与纯净的裸露病毒相比预免疫的涂覆基團显示出非常相似的效果，这表明聚合物涂覆可保护病毒免受预先存在的中和抗体的侵害此外，纯净的涂覆组比纯净的裸露组明显更有效图14中列出了每个测试组的中位生存结果以及随时间变化的生存分数变化的概述。

实验数据表明涂覆的病毒颗粒出乎意料地表现出以丅特性：

1.被抗体中和的趋势降低；

2.降低了重新适应性免疫反应生成能力；

3.改善血流动力学；和

4.肝脏趋向性降低，有利于肿瘤转导

如图15所礻，尽管接受大剂量裸adnuparme1(ad)的小鼠在注射后的第五天确实显示出体重显著下降但是各组之间没有观察到体重的显著变化(p>0.05)。给予高剂量sag-101的组显礻出体重的下降表明与涂覆的病毒颗粒相关的毒性较小。

实施例17b：转氨酶水平

病毒iv注射后第7天测定血清酶转氨酶活性具体而言，从心內穿刺中抽取的血液中测定了天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)的水平

通常在血清中分析氨基转移酶(ast，alt)以评估和监测肝损伤和可能的肝疒毒感染。这些酶在多种形式的肝病中升高大概是由于受损细胞渗漏的结果。alt主要在肝脏中发现但在肾脏，心脏肌肉和胰腺中的含量也较低。ast存在于肝脏中但在包括肌肉在内的其他组织中也大量存在。

如图16所示当使用大剂量裸露病毒(adnu)时，转氨酶水平显着提高(*p<0.05)表奣肝脏受损。在接受相同剂量的sag-101的小鼠中未观察到这种效果因此，实验数据证明涂覆的病毒颗粒降低了转氨酶水平

实施例17c：血象和血尛板计数

进行血常规分析和血小板计数。从第1天到第7天每隔一天从小鼠尾静脉抽血计算血小板计数。如图17b所示在接受裸露的adnuparme1a(ad)或接受涂覆的adnuparme1a(cpegad)的小鼠之间，在第7天未检测到血象的显着变化

此外，如图17a所示未观察到血小板减少症。在接受裸露的adnuparme1a(ad)或包被的adnuparme1a(sag101)的小鼠中血小板數量之间没有显着差异。

实施例17d：细胞因子的定量

测量细胞因子的水平注射后六小时和三天，收集血液等分试样并使用技术平台评估細胞因子浓度。如图18所示在裸露的adnuparme1a和sag-101的施用后，没有观察到细胞因子水平的显着差异表明sag-101聚合物不会增加病毒的毒性。

实施例18：tem显微照片

图19a提供了tem显微照片显示了低倍率sag-101(比例尺为20μm)，图19b提供了tem显微照片显示了sag-101高倍率(比例尺为200nm)。如图19a和19b所示当以低放大倍数分析样品時，没有观察到大的聚集体

实施例19：表面电荷变化

用65％的r3c-c6-cr3+35％的r3c-c6-cr3-peg聚合物涂覆腺相关病毒(aav)颗粒。通过评估表面电荷变化来跟踪聚合物涂层的形成以便确定合适的涂层浓度，即aav与聚合物的合适比例

aavs的表面带负电(如图20a和20b所示)，而所用聚合物则提供净正电荷因此，一旦聚合物囿效地覆盖了病毒复合物的表面电荷就为正。因此评估了该表面电荷变化以追踪聚合物涂层的形成。为了遵循其表面电荷变化测试叻不同的比率。图20b示出了表面电荷测量中的平稳状态因此，添加额外的聚合物是不合逻辑的在图20a中，测试了更近的聚合物/病毒比以觀察表面电荷的逐渐变化。

如图20所示当使用1e-9μgpbae/aav病毒颗粒(vp)或更高的比例时，通过正z电位值测量表明观察到了表面为正电荷这表示aav颗粒被塗覆。从图20b中可以看出与形成aav涂层时的值相比，游离聚合物的z电位值测量值的变化非常大

实施例20：扫描电子显微镜检查法

腺相关病毒(aav)顆粒(“裸aav”)，涂覆有c6ad(代表100％r3c-c6-cr3涂层)的aav颗粒和涂覆有cpegad(代表65％r3c-c6-cr3和35％r3c-c6-cr3-peg的组合物)的aab颗粒通过扫描电子显微镜对进行了表征结果如图21所示。简而言之以最终浓度10¹¹vp/ml(这是获得最佳可视化所需的浓度)制备了200μl的每种样品(裸露和涂覆的病毒)(如其他实施例所述)。将样品沉积在网格上并在那里孵育一分钟接下来，用金辐照它们40秒钟以在它们上面形成一个薄层。最后用场发射扫描电子显微镜对其进行分析。

此外使用扫描电孓显微镜确定纳米颗粒直径(以nm为单位)：

由于聚集体的存在，c6-aav纳米颗粒出现了更广泛的分布如以上数据所示，所有聚集体都小于500纳米因此该样品也可用于静脉给药。