环形分子的旁侧序列不包括被切割,环化,PCR扩增并测序后怎样找到两侧序列的连接点

你子的啊旁侧序列不包括被切割环化pcr扩增,并测序后那么要想找到两个序列排列的链接点的吗?也是要求记住我及其精密的

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通常采用的PCR反应必须知道欲扩增嘚DNA或RNA片段两侧的序列而在大多数情况下对某些序列本身或其旁侧序列不包括并不清楚,“锚定PCR”可以帮助克服序列未知或序列完全未知帶来的障碍

基本做法是:分离细胞总RNA或者mRNA,在反转录酶的作用下合成cDNA通过DNA末端转移酶在cDNA 3’末端加上poly(dG)尾巴。与此poly(dG)相对应的锚定引物poly(dC)为保证扩增特异性建议此段旁聚(dC)在十二聚以上,5’端可带上某些限制酶序列或其他序列信息在与基因特异配对的引物参與下,可以扩增出此带同源多聚物尾巴的cDNA序列

典型的PCR反应产生一种特定的双链DNA拷贝,不对称PCR可以利用引物浓度的差别形成单链DNA,便于測序一般采用50~100:1比例的引物浓度,在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA但当低浓度引物被消耗尽时,高浓度引物介导的PCR反应就会產生大量的单链DNA分离此扩增产物中的ssDNA可用原引物或第三条内部引物直接测序。

PCR反应允许扩的DNA片段位于已知序列的两个引物之间反向PCR的應用则可以对一个已知的DNA片段的两侧未知序列进行扩增和研究。选择已知序列内部没有的限制性内切酶对此段DNA进行酶切连接成环状DNA分子,选择合适方向和已知序列两末端互补的引物经PCR后,可以得到未知序列的DNA片段用此方法可建立基因组步移文库。

PCR技术的一个重要应用領域是检测特定序列的存在或缺失如果待检测的基因片段存在,经PCR可以产生扩增区带如果缺失则没有扩增带出现。在许多情况下需要檢测的基因十分庞大有的可达数百上千kb。对此有人提出了多重PCR即在同一个试管中加入多对引物,扩增同一模板的几个区段如果某一區段缺失则在相应的电泳图谱上这一区带就会消失。多重PCR和southern blotting 一样可靠但要简便的多。

着色互补PCR又称荧光PCR可用于区分长短相近的多种基洇成分。其原理是用不同的荧光染料如红色的罗丹明(POX)和绿色的荧光素(FAM)等分别标记于不同的寡核苷酸引物上,同时扩增多个DNA区段反应完毕后,利用分子筛除去延伸的引物用紫外线照射扩增产物,就能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合如果某一DNA区带缺失,則会缺乏相应的颜色据此可以很快诊断出是否某种基因缺失,或者发现某些感染的病毒



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