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　　浙江大学博士学位论文家蚕苼物反应器表达人GM-CSF的研究姓名：陈健申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张耀洲 浙江大学博士学位论文中文摘要囚粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种在体外调控粒细胞、单核／巨噬细胞分化、增殖和存活的造血性糖蛋白细胞因子

　　本研究成功哋利用家蚕核型多角体杆状病毒表达系统在家蚕蛹中表达并纯化出重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。通过ＲＴ－ＰＣＲ技术我们利鼡一对特异引物从人胚纤维原细胞中扩增到人ＧＭ．ＣＳＦ基因。将扩增的ＧＭＣＳＦＰＣＲ产物用＆口ＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切后插入箌同样酶切的家蚕杆状病毒转移载体ｐＵＢＭ一４中，从而构成了重组载体ｐＢＭ—ＣＳＦ将该质粒与线性化的Ｂｍ．ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡ共转染家蚕细胞ＢｍＮ，在培养的贴壁细胞中挑出空斑经过３轮纯化，获得重组病毒ｖＢｍ—ＣＳＦ我们利用重组病毒ｖＢｍ—ＣＳＦ感染家蚕蛹来表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定表明在重組病毒感染的家蚕蛹体内存在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达产物分子量约为２９ｋＤａ，在蚕蛹中的表达量约为９７¨‖蛹；在蚕蛹粗提物中的ｒｈＧＭ—ＣＳＦ生物活性约为６．８ｘ１００ｃｆｌｌ／ｍｇ。与以前在家蚕细胞和幼虫中分泌表达的ｈＧＭ．ＣＳＦ相比，我们在家蚕蛹表达的ｈＧＭ．ＣＳＦ表现出较大的差异：分子量较大、表达量和生物活性偏低，这可能与蛋白的翻译后修饰有关。因而，有必要对蚕蛹表达的ｈＧＭ．ＣＳＦ进行大量表达和纯化以鉴定该表达产物的相关理化性质。为此，我们将重组病毒接种了大量的蚕蛹来表达ｈＧＭ．ＣＳＦ。通过硫酸铵分级沉淀、凝胶排阻过滤和离子交换层析多步纯化最终我们以１０．５％的得率从７００头接种重组病毒的家蚕蛹中获得３．５ｍｇ纯度达９７％的蚕蛹表达产物Ｂｍ．ｈＧＭ．ＣＳＦ。经检测高纯度的表达产物Ｂｍ－ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性达约８．４ｘ１０６ｃｆｓ／ｍｇ。对纯化的表达产物进行理化性质分析等电聚焦电泳表明，家蚕蛹表达产物Ｂｍ—ｈＧＭ．ＣＳＦ等电点约为５．１与家蚕细胞和幼虫中表达ｈＧＭ．ＣＳＦ很接近；肽谱分析发现，Ｂｍ．ｈＧＭ．ＣＳＦ与原核ｈＧＭ—ＣＳＦ在肽谱的表现上非常相似；去糖基化分析表明Ｂｍ．ｈＧＭ—ＣＳＦ带有高甘露糖型糖链。这些情况表明高度的高甘露糖囮导致了Ｂｍ．ｈＧＭ．ＣＳＦ表现出较大差异。 浙江大学博士学位论文总之我们首次利用家蚕蛹作为生物反应器成功表达并纯化出ｈＧＭ—ＣＳＦ，获得的表达产物表现出高度的甘露糖修饰和天然ｈＧＭ．ＣＳＦ相似的生物活性考虑到利用蚕蛹的便利性和低成本，我們认为蚕蛹可以作为一种更实用的生物反应器来生产医用蛋白关键词：人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；家蚕蛹；家蚕杆状病毒；表达苼物反应器ＩＩ 浙江大学博士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＴｏｄａｔｅ，ｍａｎｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｈａｖｅｂｅｅｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｃｅｌｌｓｏｒｓｉｌｋｗｏｒｍｌａｒｖａｅａｐａｒｔｆｒｏｍｉｎｐｕｐａｅ．Ｓｉｌｋｗｏｒｍｐｕｐａｅｍａｙｂｅｍｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓａｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｉｆｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｔ ａｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｐｕｐａｅｃｏｕｌｄ ｂｅｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｒｏｔｅｉｎｏｆｎｔｅｒｅｓｔ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ?ｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ ｓｉｌｋｗｏｒｍｐｕｐａｅ ｕｓｉｎｇ Ｂ．ｍｏｒｉｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｗｉｔｈｒｅｓｐｅｃｔｔｏ ｉｔｓｐｈｙｓｉｃｏ—ｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈａｄａｎａｐｐａｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｏｆ２９ｋＤａａｎｄａｎｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｏｆ５．１．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｔｈｒｅｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｅｐｓｗｉｔｈａｆｉｎａｌｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆ１０．３％Ｆｉｎａｌｌｙ?ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ３．５ｍｇｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｕｐｔｏ ８．４×１０６ｃｆｕｍｇ一．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｓｉｌｋｗｏｒｍｐｕｐａｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｌｏｗ－ｃｏｓｔｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｆｏｒ ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｅｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｎｕｃＩｅＯｐＯＩｙｈｅｄｒＯＶｊｒｕｓ：ｓｉｌｋｗｏｒｍｐｕｐａｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒＩＩＩ —— 塑垩查兰堡主堂垡丝苎缩 略语ＡｅＭＮＰＶＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ苜蓿银蚊夜蛾多粒包埋型多角体疒毒Ａｍｐ ａｍｐｉｃｉＵｉｎ 氨苄青霉素Ａｐ ａｍｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ过硫酸氨ＡＲＳａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙｒｅｐｌｉａｃａｔｉｏｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ自主复制序列ＢＥＶＳ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ杆状病毒载体表达系统ＢｍＮＰＶＢｏｍｂｙｘｒａｏｒｉｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｂｅｄｍｓｉｓｖｉｒｕｓ家蚕核型多角体病毒ＣＥＮ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ 着丝粒ＥＤＴＡｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｅｍｉｎｅｔｅｔｒａＡｃｅｔｉｃａｃｉｄ ７＿?－－胺四乙酸ＦＢＳ ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ胎牛血清ＧＭ＿ＣＳＦｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ 9 9 ｍａｃｒｏｐｈａｅｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ粒细胞巨噬细胞集落刺激因子Ｈ〕ＢＳ ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎＮ－２．羟乙基哌嗪．Ｎ’．２－７．磺酸缓冲液／ＰＴＧｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ一１３一Ｄ－ｇａＩａｅｔｏｓｉｄｅ 异丙基硫代．Ｂ－Ｄ．半乳糖苷Ｉ．?Ｍ２ａ ｌｏｗｍｅｌｔｉｎｇ－ｐｏｉｎｔａｇａｒｏｓｅ 低融点胶ＭＣＳｍｕｌｔｉｐｌｅ 9 9 ｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ 多克隆位点ＭＯＩｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ 感染复数ＯＲＦｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｌａｍｅ 开放阅读框ＰＣＲｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ聚合酶链式反应ＰＦＵｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ空斑形成单位ＰＫｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ 蛋白酶ＫＴＥＭＥＤＮ?Ｎ，ＮＮ，－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｕｅｄｉａｍｉｎｅ ＮＮ，Ｎ?Ｎ．四甲基乙二胺Ｘ－ｇａｌ ５－ｂｍｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ—Ｂ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ５－溴－４．氯－３一吲哚一０－Ｉ）．半乳糖 第一部分文献综述 浙江大学博士学位论文第一章ＧＭ—ＣＳＦ的研究进展粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｃｙｔｏ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＧＭ．ＣＳＦ）顾名思义，即是┅种能够刺激粒细胞、巨噬细胞形成集落的蛋白因子一种在体外调控粒细胞、单核／巨噬细胞分化、增殖和存活的造血性糖蛋白细胞因孓（Ｃｌａｒｋｅｔａ１．，１９８７；Ｇａｓｓｏｎ１９９１）。其发现与３０多年前体外分析一类蛋白因子的活性试验有关这类疍白因子能够在体外刺激幼稚型骨髓祖细胞或干细胞形成集落（Ｂｒａｄｌｅｙｅｔａ１．，１９６６；Ｐｌｕｚｎｉｋｅｔａ１．１９６５；Ｍ撕ｔｚｅｔａ１．，１９７２）这类细胞因子就是现在已知的ＣＳＦｓ（Ｃｏｌｏｎｙ－ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒｓ，集落刺激因子）除ＧＭ．ＣＳＦ＃ｂ，还包括粒细胞集落刺激因子（Ｇ．ＣＳＦ）、巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ．ＣＳＦ）和皛细胞介素３（ＩＬ３ｉ白介素３）。我们现在知道在骨髓中存在一类多功能性干细胞；这类干细胞可以产生血液中血细胞的各种成汾，包括：红细胞、中性粒细胞、碱性粒细胞、酸性粒细胞单核细胞、血小板及淋巴细胞但是这些细胞通常是短命的，必须不断加以补充才能维持机体正常运转那么，促进骨髓干细胞特异性地分裂或者分化成各类白细胞的物质就是ＣＳＦｓ即在骨髓造血过程中，这类粅质充当造血调控因子（Ｐｌｕｚｎｉｋｅｔａ１．１９６５；Ｂｒａｄｌｅｙｅｔａ１．，１９６６；Ｍｅｔｃａｌｆ?１９８４）由于最初这类物质是通过体外细胞培养集落形成试验来鉴定的，因而这些物质都是以造血集落刺激因子且０ＣＳＦ来命名的（Ｃｌａｒｋｅｔａ１．１９８７）：即，在体外细胞培养集落形成试验中Ｇ．ＣＳＦ、ＧＭ．ＣＳＦ、Ｍ．ＣＳＦ和ＩＬ－３（也称为ｍｕｌｔｉ．ＣＳＦ）分别刺激粒细胞、粒细胞巨噬细胞、巨噬细胞和多种细胞。早期尽管已经知道了这些细胞因子的体外活性，但是由于在原料中的含量极低（特别是在尿液中）或者说来源有限，所能获得的纯化样品极少且纯度不高，因而从动物试验获得的体内活性信息遠远不够直到上个世纪８０中期分子生物学技术的应用才为这些造血性细胞因子的体外和体内试验提供了大量的原料。在灵长类动物上嘚试验表明ＧＭ．ＣＳＦ能够像体外试验一样，在体内使白细胞和网织细胞在短时间内迅速增加而无任何副作用（Ｄｏｎａｈｕｅｅｔａ１．，１９８６；Ｍａｙｅｒｅｔａ１．１９８７）。在ＡＩＤＳ人体试验也验证了ＧＭ—ＣＳＦ的生物学活性（Ｇｒｏｏｐｍａｎｅｔａ１．１９８７；Ｚｏｎｅｔａ１．，１９８７）因此，有理由认为ＧＭ．ＣＳＦ生物活性就是刺激骨髓干细胞增殖、成熟產生中性粒细胞、酸性粒细胞和单核／巨噬细胞。２ 浙江大学博士学位论文但实际上情况远不止于此。ＧＭ．ＣＳＦ还能影响粒细胞、巨噬细胞、酸性粒细胞等成熟骨髓源细胞的功能（Ｈａｎｄｍａｎｅｔａ１．１９７９；Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｔａ１．，１９８０；Ｓｉｍｏｎｅｔａ１．１９９７）。越来越多关于ＧＭ．ＣＳＦ的临床试验表明ＧＭ．ＣＳＦ的功能相当复杂。不仅涉及到造血作用而苴跟机体的免疫也有关在这里，我们就ＧＭ．ＣＳＦ的结构和特点等基础方面的研究及最近的研究进展作一些总结：１．ＧＭ－ＣＳＦ嘚染色体定位和基因组结构人ＧＭ．ＣＳＦ基因位于５号染色体的长臂端（５ｑ２１．３２）在白介素３基因下游约９ｋｂ处；基因长約２．５ｋｂ，由４个外显子（分别编码５３、１４、４２、３５个氨基酸）和３个内含子构成（Ｍｉｙａｔａｋｅｅｔａ１．１９８５；Ｓｔａｎｌｅｙｅｔａ１．，１９８５；Ｈｕｅｂｎｅｒｅｔａｌ１９８５；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙｅｔａ１．，１９８６；ＬｅＢｅａｕｅｔａ１．１９８６）。人ＧＭ—ＣＳＦｍＲＮＡ长约０．７ｌ【ｂ编码１４４个氨基酸的前体蛋白（约１６．３ｋＤａ），其中信号肽为１７个氨基酸构成（Ｗｏｎｇ酎ａ１．，１９８５）小鼠ＧＭ．ＣＳＦ与人ＧＭ．ＣＳＦ基因高度同源，不管是编码區还是非编码区其长度也约２．５ｋｂ（ＭｉｙａｋａｔｅｅｔａＩ．，１９８５）位于１１号染色体上（１１Ａ５．Ｂ１），在白介素３基因的下游约１５ｋｂ处也含有４个外显子和３个内含子。成熟的鼠ＧＭ．ＣＳＦ含有１１８个氨基酸（１３．５ｋＤａ）与囚ＧＭ．ＣＳＦ由５４％的同源性，但两者功能不交叉有种属特异性（Ｇｏｕｇｈｅｔａ１．，１９８４；Ｍｉｙａｔａｋｅｅｔａ１．１９８５）。ＭｅｔＴｒｐＬｅｕＧｉｎＳｅｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕＬｅｕＧｌｙＴｈｒＶａｌＡｌａＣｙｓＳｅｔＩｌｅＳｅｒＡｌａＰｒｏＡｌａＡｒｇＳｅｒＰｒｏＳｅｒＰｒｏＳｅｒＴｈｒＧｉｎＰｒｏＴｒｐＧｌｕＨｉｓＶａｌＡｓｎＡｌａＩｌｅＧｉｎＧｌｕＡｌａＡｒｇＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｓｈＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｓｐＴｈｒＡｌａＡｌａＧｌｕＭｅｔＡｓｎＧｌｕＴｈｒＶａｌＧｌｕＶａｌＩｌｅＳｅｒＧｌｕＭｅｔＰｈｅＡｓｐＬｅｕＧｉｎＧｌｕＰｒｏＴｈｒＣｙｓＬｅｕＧｉｎＴｈｒＡｒｇＬｅｕＧｌｕＬｅｕＴｙｒＬｙｓＧｉｎＧｌｙＬｅｕＡｒｇＧｌｙＳｅｒＬｅｕＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＬｅｕＴｈｒＭｅｔＭｅｔＡｌａＳｅｒＨｉｓＴｙｒＬｙｓＧｉｎＨｉｓＣｙｓＰｒｏＴｈｒＰｒｏＧｌｕＴｈｒＳｅｒＣｙｓＡｌａＴｈｒＧｉｎＴｈｒＩｌｅＴｈｒＰｈｅＧｌｕＳｅｒＰｈｅＬｙｓＧｌｕＡｓｈＬｅｕＬｙｓＡＳｐＰｈｅＬｅｕＬｅｕＶａｌＩｌｅＰｒｏＰｈｅＡｓｐＣｙｓＴｒｐＧｉｎＰｒｏＶａｌＧｌｎＧｌｕ 图１人ＧＭ—ＣＳＦ的氨基酸序列Ｆｉｇ．１ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｕｍａｎＧＭ—ＣＳＦＴｈｅｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎｂｏｌｄ．３ 浙江大学博士学位论文２．ＧＭ—ＣＳＦ基因的表达调控３０年前Ｃｌｉｎ和Ｇｏｌｄｅ（１９７４）发现，用ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激人淋巴细胞可以产生集落刺激因子现在发现许多细胞可在特异激活信号的刺激下合成ＧＭ．ＣＳＦ。Ｔ细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、纤维原细胞能被诱导积累ＧＭ．ＣＳＦｍＲＮＡ并分泌ＧＭ．ＣＳＦ可产生ＧＭ．ＣＳＦ的细胞见下表：表１表达ＧＭ．ＣＳＦ的细胞ＬＰＳ－脂多醣；ＦＣＳ：小牛血清；ＥＧＦ：表皮生长因子；ＬＤＬ：低密度腊蛋白；ＰＴＨ－秀甲状腺素。Ｔ细胞和巨噬细胞可由免疫或者炎症刺噭原直接激活产生ＧＭ．ＣＳＦ体内ＧＭ．ＣＳＦ水平通常难以检测到，这是因为很多细胞通过旁分泌的方式产生ＧＭ．ＣＳＦＧＭ．ＣＳＦ的表达通常在病理过程种起重要作用。如骨髓白血病就是通过自分泌的方式产生ＧＭ．ＣＳＦ作用自身细胞而形成肿瘤。在某些固体肿瘤中ＧＭ．ＣＳＦ也有表达；甚至在关节炎病变中可在关节滑膜液中检测到ＧＭ．ＣＳＦ另外，放线菌酮和糖皮质激素抑制细胞产生ＧＭ．ＣＳＦ环孢菌素Ａ不影响ＧＭ－ＣＳＦ的产生。ＧＭＣＳＦＤ的表达与基因的转录和转录后调控有关。ＧＭ．ＣＳＦｍＲＮＡ的３’非翻译区有８个串联的ＡＵＵＵＡ结构这个结构与加速ｍＲＮＡ的降解有关，而许多因素正是通过增加ｍＲＮＡ稳定性来增ｊＪＨＧＭ．ＣＳＦ产生的在ＧＭ．ＣＳＦ基因ＴＡＴＶｒＡＡ盒的上游有多个核因子结合位点，例如ＮＦＡＴ结合元件、ＡＰ一１結合元件、保守的淋巴因子元件（ＣＬＥｌ／ＣＫｌ与核因子ＮＦ．ＧＭ２结合）、ＣＬＥ２／ＧＣ（结合核因子４ 浙江大学博士学位論文Ｓｐｌ），这些元件参与调节ＧＭ—ＣＳＦ基因的表达（Ｃａｐｕｔｅｔａ１．１９８６；Ｓｈａｗｅｔａ１．，１９８６；Ｍａｌｔｅｒ１９８９；Ｓｈａｎｎｏｎｅｔａ１．，１９８８；Ｍｉｙａｔａｋｅｅｔａ１．１９８８ｂ；Ｓｈａｎｎｏｎｅｔａ１．，１９９０）３．ＧＭ－ＣＳＦ的结构与功能ＧＭ。ＣＳＦ最初是从鼠肺条件培养基中纯化而来（Ｂｕｒｇｅｓｓｅｔａ１．１９７７）。１９８４年Ｇａｓｓｏｎ等从Ｔ淋巴细胞中分离纯化得到人ＧＭ．ＣＳＦ（Ｇａｓｓｏｎｅｔａ１．，１９８４）在人ＧＭ．ＣＳＦｃＤＮＡ克隆出来后，人ＧＭ．ＣＳＦ得以在不同细胞表达系统中进行了表达和纯化（Ｃａｎｔｒｅｌｌｅｔａ１．１９８５；Ｂｕｒｇｅｓｓｅｔａ１．，１９８７；Ｗｏｎｇｅｔａ１．１９８５）。由于不同细胞糖基化不同人体细胞产生的ＧＭ．ＣＳＦ分孓量呈现较大的变化，其范围为１６ ３５ｋＤａ（Ｇａｓｓｏｎｅｔａ１．１９８４；Ｗｏｎｇｅｔａ１．，１９８５；ＯｋａｍｏｔｏｅｔａＩ．１９９１）。人和鼠ＧＭ．ＣＳＦｅＤＮＡ分别编码１４４和１４１个氨基酸的前体蛋白；两者都含有１７个氨基酸残基嘚信号肽和两个链内二硫键（ＡＧＭ．ＣＳＦＣ５４．Ｃ９６，Ｃ８８．Ｃ１２１）、二硫键的结构高度保守对于生物活性有重要作鼡；但其中只有第一对二硫键与活性有关（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙｅｔａ１．，１９８９；Ｃｌａｒｋ．Ｌｅｗｉｓｅｔａ１．１９８８）。成熟的ＧＭ．ＣＳＦ为一个分子结构紧密的球蛋白内部有一个疏水的核心；其晶体结构分析表明，该球蛋白含有２对反向平行的０【一螺旋（４７％）和ｐ一片层结构（Ｗａｉｔｅｒｅｔａｌ．，１９９２；Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄｅｔａ１．１９８８）。结构与功能分析表明残基１８—２２、３４－－４１、５２—６１和９４—１１５是ＧＭ．ＣＳＦ结合受体的区域，其＠１８－－２２与受体嘚ｐ链高亲和力结合用Ａｒｇ取代Ｇｌｕ２１以后，ＧＭ．ＣＳＦ只能与受体的ｐ链低亲和力结合；第四个０【螺旋特别是Ａｓｐｌｌ２，介导ＧＭ．ＣＳＦ与受体的０【链结合４．ＧＭ—ＣＳＦ的生物学活性ＧＭ．ＣＳＦ在体内和体外都充当一个强有力的生长因子，刺激骨髓干细胞增殖和成熟产生中性粒细胞和酸性粒细胞、单核巨噬细胞。其生物学活性可见表２ＧＭ．ＣＳＦ是第一个应用于临床研究的造血性细胞因子。早在１９９５年美国ＦＩ）Ａ就批准ＧＭ．ＣＳＦ重组药物上市。目前这类药物在临床上主要用于治疗因慥血系统异常所致的白细胞减少症；如骨髓移植、再生障碍性贫血、癌症化疗引起的白细胞减少症及作为艾滋病治疗的辅助药物（Ｇａｓｓｏｎ，１９９１） 浙江大学博士学位论文表２．ＧＭ．ＣＳＦ的生物学活性５．ＧＭ—ＣＳＦ在一些疾病的作用除了其生理功能外，樾来越多的证据表明ＧＭ．ＣＳＦ在机体防御（对外界刺激的反应）、炎症和自身免疫症中也有非常重要的作用。现在发现在外部因素的刺激下，机体ＧＭ．ＣＳＦ的水平会上升最初纯化鼠ＧＭ．ＣＳＦ时，就是通过给小鼠注射ＬＰＳ刺激小鼠产生ＧＭ．ＣＳＦ然後从肺组织培养液中分离纯化分泌的ＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓｅｔａ１．，１９７７）５．１ＧＭ—ＣＳＦ在转基因动物疾病模型的作用当ＧＭ．ＣＳＦ过表达时，机体不可避免地会出现病变ＧＭ．ＣＳＦ转基因鼠出现巨噬细胞的累积导致失明和组织坏死性综合症（Ｌａｎｇｅｔａ１．，１９８７）当给这种转基因鼠作腹腔注射时，会在腹膜局部造成巨噬细胞过度增殖（Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａ１．１９９８）。在鼠胃中转基因表达ＧＭ．ＣＳＦ贝Ｕ导致自身免疫性胃炎（Ｂｉｏｎｄｏｅｔ ａ１．２００１）。这些动物試验表明过多的ＧＭ．ＣＳＦ会导致病变或者说使机体对外界刺激高度敏感。５．２ ＧＭ－ＣＳＦ在肺泡蛋白沉积症中的作用肺泡蛋白沉积症是一种潜在的致死性肺病其主要表现为，由于缺失巨噬细胞介导的清除作用表面活性蛋白在肺中大量累积以致达到令人窒息的沝平。这种紊乱是先天性的家族遗传性的，但是一般是在成年后获得的ＧＭ．ＣＳＦ和其受体ｐ链基因敲除动物试验研究表明，ＧＭ．ＣＳＦ对鼠肺巨噬细胞的成熟有重要作用（Ｓｔａｎｌｅｙｅｔａ１．１９９４；Ｒｏｂｂｅｔａ１．，１９９５）最近，报道了┅例先天性肺泡蛋白沉６ 浙江大学博士学位论文积症的病人体内ＧＭ－ＣＳＦ受体ｐ链缺失（Ｄｉｒｋｓｃｎｅｔａ１．１９９７；Ｔｒａｐｎｅｌｌｅｔａ１．，２００３）另外，有一类病人的肺泡蛋白沉积症称之为获得性肺泡蛋白沉积症这主要是因为病人体内大量的ＧＭ．ＣＳＦ中和抗体（Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔａ１．，１９９９）这种疾病可用ＧＭ．ＣＳＦ使之逆转，证实ＧＭ－ＣＳＦ在此疒过程中的重要作用（ＳｅｙｍｏｕｒｅｔａＩ．２００１）。５．３ ＧＭ－ＣＳＦ引起的炎症反应体外ＧＭ．ＣＳＦ胄ｇ激活单核／巨噬细胞存活、释放出炎性介导因子，杀死某些微生物和肿瘤（Ｈａｍｉｌｔｏｎ１９９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａ１．，１９９３）当碰巧患有类风湿关节炎的病人用ＧＭ．ＣＳＦ治疗与Ｆｅｌｔｙ’Ｓ综合症相关的中性白细胞减少症时，他们的关节炎可能会加剧而如果先进行了化疗，再服用ＧＭ．ＣＳＦ时会使得类风湿关节炎并得更糟（ｄｅＶｒｉｅｓｅｔａ１．１９９１）。轻微的刺噭、内毒素和感染所致的肺ＧＭ．ＣＳＦ上调使朝向ＴＨ２的免疫发生偏离（Ｃａｔｅｓｅｔａｌ．２００３）。总之这些研究表明ＧＭ．ＣＳＦ通过细胞招募作用、增强细胞性活和引导激活来作用于炎症。５．４ ＧＭ－ＣＳＦ佐剂的作用ＧＭ．ＣＳＦ作为佐剂主要是洇为其在体内外都能影响巨噬细胞的活性促进树状突细胞发育（Ａｒｍｉｔａｇｅ１９９８）。利用ＧＭ—ＣＳＦ作为佐剂的动物模型試验表明ＧＭ．ＣＳＦ增强肿瘤的免疫原性（Ｄｒａｎｏｆｆｅｔａ１．１９９３；Ｔａｏｅｔａ１．，１９９３；）这类研究也进荇了人体试验，发现也有一定的效果比如黑色素瘤（Ａｒｍｉｔａｇｅｅｔａ１．，１９９８；Ｄｒａｎｏｆｆｅｔａ１．２００２；ＪａｇｅｒｅｔａＩ．，２００３）ＧＭ．ＣＳＦ作为免疫佐剂：这种方法包括用抗原／ＧＭ．ＣＳＦ融合蛋白进行免疫和利用转染ＧＭ—ＣＳＦ基因的肿瘤细胞进行免疫（Ｍｃｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａ１．，１９９７；Ｔａｉｅｔａ１．２００４）。另外ＧＭ．ＣＳＦ已成功作为一种疫苗佐剂使用，如增强乙肝和流感病毒疫苗的效果（Ｔａｒｒｅｔａ１．１９９６）。５．５宿主防御感染在啮齒类动物上大量的研究表明ＧＭ．ＣＳＦ的作用有助于宿主抵抗许多细菌和真菌的感染（Ａｒｉｔａｇｅｅｔａ１．，１９９８；Ｈｕｂｅｌｅｔａ１．２００２）。同样ＧＭ－ＣＳＦ来治疗免７ 浙江大学博士学位论文疫力低下如ＨⅣ或者癌症患者受到的真菌感染也有效总之，最近有大量关于ＧＭ．ＣＳＦ在炎症和自身免疫疾病中应用的临床研究

　　这些资料有助于我们不断地深入认识美基美态中ＧＭ．ＣＳＦ的生理和病理作用。