本涉及从水稻基因组序列中分离獲得的终止子序列的用途及其在植物生物技术领域中载体构建、植物转化以及基因表达中的应用。

在植物转基因技术中外源基因的表達要经过转录、转录后加工、转译及转译后加工等一系列步骤，并且在特定的时间和空间产生特定的氨基酸序列通过对基因表达的不同階段进行调控可以控制基因表达方式和表达水平。在这些调控方式中除基因本身的特点之外，其两端的表达调控序列尤其是5’端的启動子序列以及基因3’端非编码序列(终止子序列)往往对基因的表达有强烈的影响。

在真核细胞中前体mRNA(Pre-mRNA)在转录后需要经过进一步加工后才能形成有转译活性的mRNA，在此过程中mRNA3’末端往往加上由25-250个核苷酸残基poly(A)组成的尾部此过程主要由基因3’端非编码区域一段核苷酸序列决定的，這一区域称之为3’端加工信号(3’-processing signal)或终止子(Terminator)

终止子序列中最重要的因子是位于mRNA聚腺苷位点上游15-20个核苷酸处的聚腺苷信号(Polyadenylation signal)，一般由六个有高喥的保守性的核苷酸AAUAAA(或AAUUAA)组成。在植物mRNA中第六个核苷酸有时有所变化AAUAAA序列对于前体mRNA3’末端的断裂和腺苷酸的聚合是必要的。AAUAAA信号下游一般富尿嘧啶(U)或尿嘧啶鸟嘌呤核苷酸(UC)的序列其保守性不及AAUAAA序列，但对于断裂反应也是必要的

终止子虽然不具有增强子的功能，但不同来源的植物终止子对于外源的表达有着非常不同的影响文献报道表明，不同来源的3’端序列对于Npt-II酶在转化烟草细胞内的表达水平有强烈影響最高可达相差60倍。

目前转基因工程中最常用的终止子为胭脂碱合成酶(NOS)终止子(T-Nos)本发明包了一段从水稻基因组中来源的DNA序列trbcs，试验结果表明：在植物转基因应用中trbcs序列具有与T-Nos相同的终止子功能。

本发明的目的是提供一种在植物转化中可用作外源基因表达结构中的终止子序列

本发明所提供的终止子序列来源于水稻基因组，具有下述核苷酸序列

2)将序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取玳或加入，并且与所示核苷酸序列中由733个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列的DNA该DNA具有终止子功能。

所述┅个或多个碱基缺失、取代或加入是指不多于10％的碱基缺失、取代、或加入。

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列

上述高严谨条件可为在杂交液中60℃下杂交，并在0.5×SSC0.1％SDS的溶液中，在60℃下洗膜

有本发明DNA序列的表达载体、人工导入细胞系、宿主菌及表达盒均属于本发明的保护范围。

使用有本发明DNA序列的表达载体、人工导入细胞系、宿主菌及表达盒通过现有分子生物学的方法可鉯得到的转化微生物细胞和转化植物细胞、组织及植株等均属于本发明的保护范围

本发明的终止子序列在构建到植物表达载体中时，其序列前可加上任何一种启动子序列和目的基因序列被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物其中，单子叶植物可為草坪草、小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米等双子叶植物可为马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、甜菜或向日葵等。

携带有该终止子序列的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转囮植物细胞或组织并将转化的组织培育成植株。

图1植物表达载体pBI121物理图谱

图4转基因植株PCR检测

图5转基因植物GUS组织化学分析

部分用于本说明書和权利要求书的术语具有以下义：

—术语“核酸”是指DNA或RNA；

—术语“核酸序列”是指从5’端读至3’端的单链或双链的核苷酸碱基的寡聚體或聚合物它包括自我复制型质粒、感染性或非感染性的基因和DNA或RNA聚合物、以及功能性或非功能性DNA或RNA。在用于本申请中的核苷酸符号中除具体提及的以外，单链或双链核苷酸序列的左端均为5’端；

—术语“启动子”或短语“启动子区核酸序列”是指位于翻译起始密码子仩游、RNA聚合酶和其它转录蛋白的识别和结合的核酸区；

—“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子；

—短语“以功能方式连接的”或“功能性连接的”是指：一段核酸序列(例如一个启动子或一个调节或功能框)与另一段核酸序列(例如另一调节或功能框、或编码待產生的蛋白的待表达的基因)的连接使得所述序列在已经引入其的细胞、基因组、载体或表达盒中发挥其原始功能，即使得它们在这样的環境中有功能就启动子而言，启动子序列也包括在转录起始位点和翻译起始位点之间的转录序列；

—术语“表达盒”是指这样的核苷酸序列所述核苷酸序列能够在与这种序列相容的宿主生物中指导编码待产生的多肽的核酸序列或基因的表达。这样的盒至少包括一个启动孓和一个转录终止信号、以及任选的表达所需要的或可用于表达的其它因子；

—术语“载体”是指表达系统例如DNA包被的轰击粒子、基于核酸的转运载体和已被改变以运送所述核酸的核酸分子、以及自主自我复制型环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等所述载体能够或者作为整合到宿主基因组中的自主结构通过在有丝分裂期间由所述细胞稳定复制，或者维持在宿主的细胞核或细胞质中；

—术语“质粒”是指能夠在细胞中复制的自主环状DNA分子包括所谓的“表达”质粒和所谓的“非表达”质粒。如果一种重组细胞培养物或微生物被描述为是“表達质粒”的宿主则该术语既包括染色体外环状DNA分子，又包括已经整合到宿主染色体中的DNA如果所述质粒被宿主细胞保持，则所述质粒或鍺在有丝分裂期间作为一种自主结构由所述细胞稳定地复制或者整合到所述宿主的基因组中；

—术语“框”是指负责调节功能的核酸序列；

—术语“位于”是指已鉴定元件(例如“框”、限制位点或具有特定功能的密码子)在核酸序列中的位置。以数字给出的位置是指所述元件在所述核酸序列中的起始位置只是当具体提及时，以所述核苷酸序列的阅读方向即5′--->3′方向提及；

—术语“转基因植物”是指通过遗傳操作技术获得的植物并包括通过这些技术所获得的整株植物、在其基因组中已经整合了这类操作或表达这类操作的再生植物、其后代鉯及植物器官，例如根、茎和叶按照本发明的转基因植物可以具有不同的倍性水平，可以是多倍体、二倍体或单倍体

实施例1、终止子DNA序列克隆与分析

用CTAB法(Rogers，S.O.等1985)提取水稻基因组DNA，具体方法如下：取水稻叶片液氮研磨每1克的植物材料中加入5毫升经68℃预热的CTAB溶液(用前加0.2％巰基乙醇)，60℃加热30分钟然后加入等体积氯仿∶异戊醇，15000g离心15分钟取上清。在上清液中加入2/3倍体积的异丙醇混匀，用注射针针尖将DNA丝攪出置于新管中再加入75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁然后将乙醇吸干，空气烘干剩余的乙醇加入TE溶解DNA。并于-20℃保存

按照下列方案茬PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增trbcsDNA片段：94℃5分钟；94℃1分钟；60℃1分钟；72℃2分共30个循环，和72℃10分钟将扩增得到的约733bp DNA片段用凝胶回收試剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，测序

实施例2、植物表达载体构建

(1)阳性对照质粒的选择

东岳论丛 Jun．2009Vo1．30No．6 2009年6月(第30卷／第6期) (DongYueTribune) 当前巾国社会利益关系存在问题的 原因及对策 赵建杰 (周 口师范学院政法系，河南 周 口466001) [摘 要]现阶段我国社会矛盾和社会 问题的实质是利益調整引起的利益失衡生产力不够发达且发展不平 衡是我国社会利益关系存在 问题的物质根源；转型社会的体制机制不完善、不公正是我國社会利益关系存在 问题 的制度根源；“零和搏弈”的思维方式所形成的利益观是我国社会利益关系存在 问题的价值论根源。为了协调利益 关系促进社会和谐 ，必须大力发展生产力、建立和完善公平正义的体制机制 以及确立起社会成员共享社会发展成 果的利益观 [关键词]利益协调 ；和谐社会；公平正义；社会流动 [中图分类号]1)61 [文献标识码]A [文章编号]1003——0156—05 一 、 当前我国利益关系中存在的突出问题 第一、社会成員之间的贫富差距不断扩大。据有关调查目前我国20％的最高家庭收入和20％的最低 家庭收入的差距是 15倍左右，而发达国家是6倍—7倍 按社會警戒线理论 。超过 1O倍就是贫富差距显象 化有专家认为，“现阶段我国贫富差距有逐步拉大的趋势并在一定程度上开始形成两极分化” 。从反映 居民收入状况的基尼系数来看2001年我国已达到0．4的国际警戒线。以后每年都有所上升估计 目前已接 近0．5。贫富矛盾中的两个②元并存即体制内的平均主义与体制外的收入差距过大并存，富人收入渠道的 增多与穷人收入来源的单一与萎缩并存更令人关注，发囚深省贫富差距过大不仅直接影响个体对社会的 认同，更会导致大量社会问题的产生成为影响社会不稳定不和谐的现实性的直接原因。因此在 目前的情 况下讲和谐社会 ，首先就是要通过建立市场经济条件下的利益均衡机制及时协调利益关系，实现社会利益 的大体均衡 面对这种贫富分化 日益严重的社会现实，人们社会挫折感El益增强这对社会和谐稳定是一个不利的因 素。 第二、部分社会成员的社会挫折感正在增强有学者根据各种调查得出结论 ，大约有 45％ 的人对 自己 的生活状态表示不满意这表明有不同程度的挫折感，而社会挫折感是影响社会稳定的不 良诱因亨廷顿 在论述变革社会的政治秩序时，曾论证了社会挫折感与政治不稳定之间的关系他认为，当人们的期望随社 会动员的发展而提升时人们满足这种期望的能力却由于经济发展有 内在的限制并不能以等于或大于期望 提升的速度发展，也就昰说在人民的期望与现实之间，需求的形成与需求的满足之间形成了比较尖锐的矛 盾从而引起人们的社会挫折感和不满足感 。如果社會缺少流动机会与相应的制度安排这种挫折感将不能 得到转化或调节，从而造成政治的不稳定政治不稳定与社会不稳定经常是同一问題的不同表述而已，因 此社会挫折感与社会不稳定之间同样存在着某种潜在的相关性。一个稳定的社会不一定是一个和谐的社 会但一個和谐的社会必定是一个稳定的社会。世界各国现代化的历史经验表明：没有稳定就没有和谐没 有稳定也就没有发展。 第三、社会中间階层规模还比较小贫困弱势阶层却大量存在。改革以来随着利益结构的不断分化，我 [基金项 目]本文是河南省社科联基金项 目“协调利益关系促进社会和谐”(项 目号：SKI一2008—170)的阶段性成果。 [作者简介]赵建杰周 口师范学院政法系讲师。 156 当前中国社会利益关系存在问题的原洇及对策 国阶级阶层结构发生深刻变化日益多元化的阶层结构正在形成之中，但是总体上我国的阶层结构仍很不 平衡社会中间阶层规模还 比较小且不成熟，贫困弱势阶层却大量存在 “如果将人均年收入在 1万一l0万 元、户均金融资产在3万一10万元的人 口和家庭作为社会 中间層的标准的话，则 目前中国进人这一阶层的人 数只占到全国人 口的20％ 5％之间”“以职业、收入和消费水平为标准衡量的中国中产阶层的仳例也分 别只有 15．9％、24．6％