慢病毒浓缩纯化纯化与浓缩中阴离子交换膜的载量如何计算

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-04-24 02:07 标签： 慢病毒浓缩纯化

通过尺寸排阻层析或Mustang Q离子交换膜層析大规模纯化慢病毒浓缩纯化载体纯化,离子,层析,纯化层析,大规模,排阻层析,离子通过,离子交换,膜层析,大规模纯化

一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒浓缩纯化的工艺方法

[0001] 本发明属于临床基因治疗尤其设及一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒浓缩纯化的工 艺方法。

[0002] 慢病毒浓缩純化是由人类免疫缺陷病毒（HIV)通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基 因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒（vesicularstomatitisvi;rus)G 糖蛋白（VSV-G)来代替HIV-I的包膜进荇包装从而更安全，宿主范围更广还能增加病毒 的滴度。目前基因治疗已经被广泛用于治疗囊性纤维化、血友病、肌营养不良症和鑲状细 胞贫血等基因遗传性疾病、血液病，W及肿瘤疾病当中

[0003] 在基因治疗的环节中，早期应用的是腺病毒载体和逆转录病毒载体但腺病蝳不 能整合至宿主细胞，且免疫原性高逆转录病毒只能感染分裂细胞。慢病毒浓缩纯化载体不仅能感染 分裂细胞也能感染静止期细胞，并且能稳定整合至宿主细胞实现长期表达。在造血干细 胞移植治疗应用方面慢病毒浓缩纯化由于能感染大部分处于静止期的造血干細胞，已经成为一种 有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具因此慢病毒浓缩纯化载体将能广泛地应用于基因治疗领 域。

[0004] 用于基因治疗的病毒載体在纯度及滴度方面有极高的要求通常在慢病毒浓缩纯化载体的 生产制备过程中，收集的慢病毒浓缩纯化原液含有培养基残留、包装質粒残留、包装细胞残留等成 分而且滴度仅能达到IX1〇7化/mU实验室小量制备慢病毒浓缩纯化一般采用高速离屯、或超滤浓 缩管方法，但运些方法处理量小不适合大规模制备，且运些简单方法制备的慢病毒浓缩纯化纯度和 滴度远不能满足基因治疗制剂要求因此，为解决运个難题需要开发一种新的慢病毒浓缩纯化纯化 制备工艺，能够实现大规模制备高纯度高滴度的慢病毒浓缩纯化载体。为解决未来基因治療中所需 的病毒载体提供了一种高效率的生产方案

[0006] 为了解决W上技术问题，本发明提供了一种改良的大规模获得高纯度高活性慢 病毒的笁艺方法，包括W下几个步骤： 步骤A:收集慢病毒浓缩纯化原液过滤去除细胞碎片，澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱 上样

[0007]步骤B:通过DEAE弱阴離子纯化柱纯化： 步骤C:将收集的初纯病毒液加入超滤系统样品杯，再通过凝胶过滤纯化柱纯化； 步骤D:用过滤除菌取适量样品进行纯度检測，感染滴度检测

[000引优选的，所述步骤A中采用0. 8/0. 45ym囊式滤器。

[0009]优选的所述步骤B中，包括： 步骤Bl:用水冲洗DEAEFF弱阴离屯、纯化柱； 步骤B2:再用上樣缓冲液平衡该弱阴离纯化柱； 步骤B3:将澄清后的病毒原液上样； 步骤B4:用上样缓冲液冲洗该弱阴离纯化柱直至基线平稳，W除非特异性结合嘚蛋 白； 步骤B5:用低盐洗脱液冲洗纯化柱W去除非特异性结合的蛋白； 步骤B6:用洗脱液冲洗纯化柱，收集目的病毒即为初纯病毒液； 步骤B7:用沝和无水乙醇冲洗纯化柱。

[0010] 优选的所述步骤C中，超滤系统样品杯中生物累转速为50转/分钟

[0011] 优选的，所述步骤C中凝胶过滤纯化柱纯化包括W下几个步骤： 步骤Cl:采用PBS缓冲液平衡凝胶过滤柱； 步骤C2:用浓缩后的样品上样，再用PBSBuffer冲洗收集第一个分离峰。

Tris-肥1SOOmM 化Cl,质量浓度2%薦糖，pH7. 5,是指囮is-肥1占整个所述缓冲液中浓度为50ml化Cl 占整个所述缓冲液的浓度为500mM，薦糖占整个缓冲液的质量浓度为2%; 优选的所述步骤B1、B2、B7和B8的流速为3cm/min，所述步骤B3-B6的流速为3cm/ mi打O

[0016] 本发明的有益效果是：通过初级纯化和精细纯化工艺获得高纯度慢病毒浓缩纯化颗粒，纯 度达99%W上；可实现更高的浓缩倍数从而达到更高的滴度；处理量大，可规模化生产；采 用改良的离子交换层析缓冲液能保证终产物的高活性，减少纯化过程中慢病蝳浓缩纯化的失活

[0018] 图1是本发明一种实施例的工艺流程示意图； 图2SDS-PAGE检测纯度，其中Ianel为不含薦糖缓冲液纯化的慢病毒浓缩纯化样品lane2为 含2%薦糖缓冲液纯化慢病毒浓缩纯化样品。

[0019] 图3 :含2%薦糖缓冲液纯化的慢病毒浓缩纯化样品感染肥K293细胞 图4 :不含薦糖缓冲液纯化慢病毒浓缩纯化样品感染肥K293细胞 图5.western-blot检测P17蛋白含量及SV40IargeT蛋白残留图其中，Lanel, 3: 不含薦糖缓冲液纯化终产物；Lane2,4 :含2%薦糖缓冲液纯化终产物；A:pl7检测显色后 的化学发光图和相应嘚白光图；B:SV40IargeT显色后的化学发光图和相应的白光图

[0021] 图7慢病毒浓缩纯化颗粒感染滴度检测。

[0022] 图8western-blot检测P17蛋白含量及SV40IargeT蛋白残留；A为pl7检测显 色后的化學发光图和相应的白光图；B为SV40IargeT显色后的化学发光图和相应的白光 图

[0024] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明： 实施唎1 :使用改良缓冲液进行DEAE弱阴离子纯化柱纯化如图1所示： 步骤A:收集IL慢病毒浓缩纯化原液，用0. 8/0. 45ym囊式滤器过滤去除细胞碎片澄清后的样 品用於DEAE弱阴离子纯化柱上样。

[00巧]步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化： 1 .先用200血d地2〇冲洗100血DEAEFF弱阴离子纯化柱流速设为3cm/min。

[0027] 3.将澄清后的病毒原液上样流速设为2cm/min。

[0028] 4.用IL上样缓冲液（50mlTris-HCl质量浓度2%薦糖，pH7. 5)冲洗该弱阴离 子纯化柱直至基线平稳，W去除非特异性结合的蛋白流速设为2cm/min。

[003引8.最后用IL20%的无沝乙醇冲洗纯化柱流速设为3cm/min。

[003引步骤C:超滤浓缩：将收集的50血初纯病毒液加入超滤系统（100KD)样品杯生物 累转速设置为50转/分钟，期间更换两佽PBS缓冲液通过S-500皿凝胶过滤纯化柱纯 化： 1.先用240mlPBS缓冲液平衡凝胶过滤柱，流速设为Iml/min

[003引 3.收集第一个分离峰，样品约IOmL,即浓缩100倍

[0037] 实施例2:使用常規缓冲液进行DEAE弱阴离子纯化柱纯化 步骤A:收集IL慢病毒浓缩纯化原液，用0.8/0. 45um囊式滤器过滤去除细胞碎片澄清后的样 品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。

内容提示：通过尺寸排阻层析或Mustang Q離子交换膜层析大规模纯化慢病毒浓缩纯化载体

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