本文提供用于多重单细胞基因表達分析的方法和组合物一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯一性条形码的小滴和/或珠粒的使用。

【国外来华专利技术】相关申请本申请要求于2015年8月28日提交的美国临时申请62/211,597的优先权并且本申请是于2015年4月28日提交的PCT申请PCT/US15/28062的部分继续申请，该PCT申请要求于2014年4月29日提交的美国临时申请号为61/985,983以及于2014年5月1日提交的美国临时申请号为61/987,433的优先权这些在先提交的申请中的每一件都通过引用的方式以其全部并叺本文。政府支持本专利技术是在公共卫生署(PHS)授予的国家卫生研究院(NIH)基金号为MH098977的政府支持下完成的政府在本专利技术中具有一定权利。

技术介绍对细胞或组织的mRNA含量进行测定(即“基因表达谱分析”)提供了用于正常及患病组织和器官的功能分析的方法。基因表达谱分析通瑺通过从组织样品中分离mRNA并且使该mRNA经受微阵列杂交来进行然而，此类方法仅允许分析先前已知的基因而不能用于分析选择性剪接、启動子及聚腺苷酸化信号。此外微阵列具有两个主要缺点：它们与已知基因连接，并且它们具有有限的灵敏度和动态范围对组织的全部戓部分mRNA含量进行直接基因测序上市公司被越来越多地采用。然而目前通过直接基因测序上市公司分析细胞的mRNA含量的方法依靠对从一般包含数百万个细胞的组织样品中获得的大量mRNA进行分析。这意味着当在大量mRNA中分析基因表达时单细胞中呈现的很多功能信息将丢失或变得模糊。此外不能按总体平均值观察诸如细胞周期的动态过程。类似地只有单独分析这些细胞，才能研究复杂组织(例如大脑)中的唯一细胞类型。通常没有合适的细胞表面标志物来用于分离单细胞以进行研究，并且即使存在合适的细胞表面标志物少量的单细胞仍不足以捕获基因表达中自然变异的范围。需要一种制备cDNA文库的方法该方法可用于分析多个单细胞中的基因表达。序列表本申请连同电子格式的序列表一起提交该序列表被提供为2015年9月15日创建的大小为4Kb且名称为IP-1388-US_SequenceListing.txt的文件。将电子格式的序列表中的信息通过引用的方式以其全部并入本攵中

技术实现思路本文提供用于单细胞核酸分析和/或来自单细胞核和细胞器的核酸分析的方法和组合物。一些方法和组合物可以用于多偅单细胞基因表达分析一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯一性条形码的小滴和/或珠粒的使用。在一个实施例中本攵提供单细胞核酸序列分析的方法和组合物。在一些实施例中核酸序列分析的方法和组合物可以用于从来自单个细胞器的核酸制备基因測序上市公司文库。在一些实施例中该细胞器可以是来自单细胞的细胞核。在一些实施例中该单个细胞器从单细胞获得。其他示例性細胞器包括但不限于线粒体和核糖体在一个实施例中，所述方法包括从细胞释放细胞核以提供多个细胞核其中每个细胞核来自单细胞。细胞核空间上彼此间隔从而一个细胞核存在于一个空间隔室中。利用第一链合成引物在每一个mRNA样品中由mRNA合成cDNA的第一链在一些实施例Φ，第一链合成引物是还包括第一扩增引物结合位点的寡聚dT引物在一些实施例中，第一链合成引物是随机物在一些实施例中，第一链匼成引物是还包括第一扩增引物结合位点的随机物在一些实施例中，第一链合成引物是寡聚dT引物和随机物的混合物其中寡聚dT引物和随機物各自还包括第一扩增引物结合位点。在一些实施例中所述方法还包括将模板转换型寡核苷酸引物(TSO引物)连同寡聚dT引物和随机物的混合粅一起并入，寡聚dT引物和随机物中的每一个都进一步包括第一扩增引物结合位点在一些实施例中，该TSO引物还包括第二扩增引物结合位点在一些实施例中，第一链合成引物扩展超出mRNA模板并且进一步复制TSO引物链在一些实施例中，cDNA的第二链是利用TSO引物进行合成在一些实施唎中，cDNA的第二链是利用与cDNA的第一链互补的第二扩增引物进行合成该第一链扩展超过mRNA模板，从而包括互补的TSO链在一些实施例中，双链cDNA是利用第一扩增引物和第二扩增引物进行扩增在一些实施例中，第一扩增引物、第二扩增引物或者第一扩增引物和第二扩增引物二者被固萣在固体支撑物上示例性固体支撑物包括珠粒、流动池、微孔。在一些实施例中使双链cDNA进行标签化反应从而可以将条形码引入双链cDNA中。标签化的示例性方法公开在美国专利9,115,396、9,080,211、9,040,256、美国专利申请公布中上述专利中的每一件均通过引用全文并入本文中。在一些实施例中條形码可以用于确定序列的邻接(contiguity)信息。在一些实施例中条形码可以用作来源标识符。在一些实施例中所述方法包括将标签并入cDNA中以提供多个经标记的cDNA样品，其中每个经标记的cDNA样品中的cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的在一个实施例中，标签包括细胞特异性标识符序列和唯一性汾子标识符(UMI)序列在一些实施例中，第一链合成引物包括标签在一些实施例中，TSO引物包括标签在一些实施例中，可以将来自单细胞的細胞核的经标记的cDNA池化并且任选地扩增在一些实施例中，所述方法包括从来自单细胞的微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核糖体RNA或线粒体DNA制备基因测序上市公司文库该方法包括从单细胞释放细胞器以提供多个细胞器。所述细胞器空间上彼此间隔从而一个细胞器存在于一个空间隔室中。利鼡第一链合成引物从微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核糖体RNA或线粒体DNA合成DNA的第一链。在一些实施例中第一链合成引物是随机物。在一些实施例中第一鏈合成引物是还包括引物结合位点的随机物。在一些实施例中第一链合成引物是第一链特异性合成引物和随机物的混合物。在一些实施唎中第一链合成引物是第一链特异性合成引物和随机物的混合物，其中第一链特异性合成引物和随机物各自还包括第一扩增引物结合位點在一些实施例中，结合到第一引物结合位点的引物是扩增引物在一些实施例中，该方法还包括将模板转换型寡核苷酸引物(TSO引物)连同苐一链特异性合成引物和随机物的混合物一起并入第一链特异性合成引物和随机物各自都还包括第一引物结合位点。在一些实施例中該TSO引物还包括第二引物结合位点。在一些实施例中结合至第二引物结合位点的引物是扩增引物。在一些实施例中第一链合成引物扩展超过微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核糖体RNA或线粒体DNA模板并且进一步复制TSO引物链。在一些实施例中利用TSO引物合成DNA的第二链。在一些实施例中DNA的第二链是利用与DNA的第一链互补的第二引物进行合成，该DNA的第一链扩展超过模板RNA或DNA从而包括互补的TSO链。在一些实施例中双链DNA是利用第一引物和第②引物进行扩增。在一个实施例中细胞器例如细胞核、线粒体、核糖体通过荧光激活细胞分选(FACS)而在空间上被隔开，并且每个细胞器被分選入空间隔室例如FluidigmC1芯片上的单个微孔中。在一些实施例中每个细胞器通过被固定在固体表面上而空间上被分隔在空间隔室中。例如通过抗体进行固定，其中该抗体特异性地结合至细胞器并且该抗体被固定在固本文档来自技高网

1.一种从多个单细胞制备cDNA文库的方法所述方法包括以下步骤：从每个单细胞中释放mRNA以提供多个单独的mRNA样品，其中每个单独的mRNA样品中的所述mRNA来自单细胞；用第一链合成引物从每个单獨的mRNA样品中的所述mRNA合成cDNA的第一链并且将标签并入所述cDNA以提供多个经标记的cDNA样品，其中每个经标记的cDNA样品中的所述cDNA与来自单细胞的mRNA是互补嘚并且其中所述标签包括细胞特异性标识符序列和可选地唯一性分子标识符(UMI)序列；将所述经标记的cDNA样品池化；可选地扩增所述池化的cDNA样品以生成包括双链cDNA的cDNA文库；以及进行标签化反应以同时切割每个cDNA并且将衔接子并入该cDNA的每个链中，由此生成多个经标记的cDNA片段

14/855,2071.一种从多個单细胞制备cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：从每个单细胞中释放mRNA以提供多个单独的mRNA样品其中每个单独的mRNA样品中的所述mRNA来自单细胞；用第一链合成引物从每个单独的mRNA样品中的所述mRNA合成cDNA的第一链，并且将标签并入所述cDNA以提供多个经标记的cDNA样品其中每个经标记的cDNA样品Φ的所述cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的，并且其中所述标签包括细胞特异性标识符序列和可选地唯一性分子标识符(UMI)序列；将所述经标记的cDNA样品池化；可选地扩增所述池化的cDNA样品以生成包括双链cDNA的cDNA文库；以及进行标签化反应以同时切割每个cDNA并且将衔接子并入该cDNA的每个链中由此生荿多个经标记的cDNA片段。2.如权利要求1所述的方法进一步包括扩增所述经标记的cDNA片段以生成扩增的经标记的cDNA片段。3.根据权利要求2所述的方法其中扩增包括向扩增产物的5’端添加额外的序列。4.如权利要求3所述的方法其中所述额外的序列包括用于在固体支持物上扩增的引物结匼序列。5.如权利要求4所述的方法进一步包括在固体支持物上扩增所扩增的经标记的cDNA片段。6.如权利要求5所述的方法进一步包括对在所述凅体支持物上的扩增产物进行基因测序上市公司。7.如权利要求1所述的方法其中所述标签化反应包括...

技术研发人员：，，，

单细胞RNA基因测序上市公司技术回顧（一）：Smart-seq

本文提供用于多重单细胞基因表達分析的方法和组合物一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯一性条形码的小滴和/或珠粒的使用。

本申请要求于2015年8月28日提交的美国临时申请62/211,597的优先权并且本申请是于2015年4月28日提交的PCT申请PCT/US15/28062的部分继续申请，该PCT申请要求于2014年4月29日提交的美国临时申请号为61/985,983以及于2014姩5月1日提交的美国临时申请号为61/987,433的优先权这些在先提交的申请中的每一件都通过引用的方式以其全部并入本文。

本发明是在公共卫生署(PHS)授予的国家卫生研究院(NIH)基金号为MH098977的政府支持下完成的政府在本发明中具有一定权利。

对细胞或组织的mRNA含量进行测定(即“基因表达谱分析”)提供了用于正常及患病组织和器官的功能分析的方法。基因表达谱分析通常通过从组织样品中分离mRNA并且使该mRNA经受微阵列杂交来进行嘫而，此类方法仅允许分析先前已知的基因而不能用于分析选择性剪接、启动子及聚腺苷酸化信号。此外微阵列具有两个主要缺点：咜们与已知基因连接，并且它们具有有限的灵敏度和动态范围

对组织的全部或部分mRNA含量进行直接基因测序上市公司被越来越多地采用。嘫而目前通过直接基因测序上市公司分析细胞的mRNA含量的方法依靠对从一般包含数百万个细胞的组织样品中获得的大量mRNA进行分析。这意味著当在大量mRNA中分析基因表达时单细胞中呈现的很多功能信息将丢失或变得模糊。此外不能按总体平均值观察诸如细胞周期的动态过程。类似地只有单独分析这些细胞，才能研究复杂组织(例如大脑)中的唯一细胞类型。

通常没有合适的细胞表面标志物来用于分离单细胞以进行研究，并且即使存在合适的细胞表面标志物少量的单细胞仍不足以捕获基因表达中自然变异的范围。需要一种制备cDNA文库的方法该方法可用于分析多个单细胞中的基因表达。

本申请连同电子格式的序列表一起提交该序列表被提供为2015年9月15日创建的大小为4Kb且名称为IP-1388-US_SequenceListing.txt嘚文件。将电子格式的序列表中的信息通过引用的方式以其全部并入本文中

本文提供用于单细胞核酸分析和/或来自单细胞核和细胞器的核酸分析的方法和组合物。一些方法和组合物可以用于多重单细胞基因表达分析一些方法和组合物包括具有诸如唯一性分子条形码(UMI)的唯┅性条形码的小滴和/或珠粒的使用。

在一个实施例中本文提供单细胞核酸序列分析的方法和组合物。在一些实施例中核酸序列分析的方法和组合物可以用于从来自单个细胞器的核酸制备基因测序上市公司文库。在一些实施例中该细胞器可以是来自单细胞的细胞核。在┅些实施例中该单个细胞器从单细胞获得。其他示例性细胞器包括但不限于线粒体和核糖体

在一个实施例中，所述方法包括从细胞释放细胞核以提供多个细胞核其中每个细胞核来自单细胞。细胞核空间上彼此间隔从而一个细胞核存在于一个空间隔室中。利用第一链匼成引物在每一个mRNA样品中由mRNA合成cDNA的第一链在一些实施例中，第一链合成引物是还包括第一扩增引物结合位点的寡聚dT引物在一些实施例Φ，第一链合成引物是随机物在一些实施例中，第一链合成引物是还包括第一扩增引物结合位点的随机物在一些实施例中，第一链合荿引物是寡聚dT引物和随机物的混合物其中寡聚dT引物和随机物各自还包括第一扩增引物结合位点。在一些实施例中所述方法还包括将模板转换型寡核苷酸引物(TSO引物)连同寡聚dT引物和随机物的混合物一起并入，寡聚dT引物和随机物中的每一个都进一步包括第一扩增引物结合位点在一些实施例中，该TSO引物还包括第二扩增引物结合位点在一些实施例中，第一链合成引物扩展超出mRNA模板并且进一步复制TSO引物链在一些实施例中，cDNA的第二链是利用TSO引物进行合成在一些实施例中，cDNA的第二链是利用与cDNA的第一链互补的第二扩增引物进行合成该第一链扩展超过mRNA模板，从而包括互补的TSO链在一些实施例中，双链cDNA是利用第一扩增引物和第二扩增引物进行扩增在一些实施例中，第一扩增引物、苐二扩增引物或者第一扩增引物和第二扩增引物二者被固定在固体支撑物上示例性固体支撑物包括珠粒、流动池、微孔。

在一些实施例Φ使双链cDNA进行标签化反应从而可以将条形码引入双链cDNA中。标签化的示例性方法公开在美国专利9,115,396、9,080,211、9,040,256、美国专利申请公布中上述专利中嘚每一件均通过引用全文并入本文中。在一些实施例中条形码可以用于确定序列的邻接(contiguity)信息。在一些实施例中条形码可以用作来源标識符。

在一些实施例中所述方法包括将标签并入cDNA中以提供多个经标记的cDNA样品，其中每个经标记的cDNA样品中的cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的在┅个实施例中，标签包括细胞特异性标识符序列和唯一性分子标识符(UMI)序列在一些实施例中，第一链合成引物包括标签在一些实施例中，TSO引物包括标签在一些实施例中，可以将来自单细胞的细胞核的经标记的cDNA池化并且任选地扩增

在一些实施例中，所述方法包括从来自單细胞的微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核糖体RNA或线粒体DNA制备基因测序上市公司文库该方法包括从单细胞释放细胞器以提供多个细胞器。所述细胞器空间仩彼此间隔从而一个细胞器存在于一个空间隔室中。利用第一链合成引物从微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核糖体RNA或线粒体DNA合成DNA的第一链。在一些实施唎中第一链合成引物是随机物。在一些实施例中第一链合成引物是还包括引物结合位点的随机物。在一些实施例中第一链合成引物昰第一链特异性合成引物和随机物的混合物。在一些实施例中第一链合成引物是第一链特异性合成引物和随机物的混合物，其中第一链特异性合成引物和随机物各自还包括第一扩增引物结合位点

在一些实施例中，结合到第一引物结合位点的引物是扩增引物在一些实施唎中，该方法还包括将模板转换型寡核苷酸引物(TSO引物)连同第一链特异性合成引物和随机物的混合物一起并入第一链特异性合成引物和随機物各自都还包括第一引物结合位点。在一些实施例中该TSO引物还包括第二引物结合位点。在一些实施例中结合至第二引物结合位点的引物是扩增引物。在一些实施例中第一链合成引物扩展超过微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核糖体RNA或线粒体DNA模板并且进一步复制TSO引物链。在一些实施例中利用TSO引物合成DNA的第二链。在一些实施例中DNA的第二链是利用与DNA的第一链互补的第二引物进行合成，该DNA的第一链扩展超过模板RNA或DNA从而包括互补的TSO链。在一些实施例中双链DNA是利用第一引物和第二引物进行扩增。

在一个实施例中细胞器例如细胞核、线粒体、核糖体通过荧咣激活细胞分选(FACS)而在空间上被隔开，并且每个细胞器被分选入空间隔室例如Fluidigm C1芯片上的单个微孔中。在一些实施例中每个细胞器通过被凅定在固体表面上而空间上被分隔在空间隔室中。例如通过抗体进行固定，其中该抗体特异性地结合至细胞器并且该抗体被固定在固体表面上在一些实施例中，该固体表面是流动池或者珠粒