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&什么是T-SPOT.TB检查？
什么是T-SPOT.TB检查？
什么是T-SPOT.TB检查？More than one third of the world’s population is infected with Mycobacterium tuberculosis. ——The World Health Organization(WHO) 世界有超过三分之一的人曾经过结核分枝杆菌。 ——世界卫生组织（干酪样坏死）1.&&&&& T-SPOT.TB 判断结核杆菌新方法目前结核分枝杆菌诊断主要检测方法有结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核PCR检测等。临床数据显示，不同检测方法对结核分枝杆菌的检出率均有一定效果。同时也发现，对于相同的送检标本组织，采用不同的检测方法会出现存在明显差异的检测结果。随着基因工程的不断发展，有力地推动了临床检验从宏观扩展到微观领域，从细胞水平深入到分子水平。研究人员发现效应T细胞被近期暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。基于这一研究发现，T-SPOT.TB 检测利用结核特异抗原ESAT-6及CFP-10，通过酶联免疫斑点技术ELISPOT检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否结核杆菌（现症）。2.&&&&& T-SPOT.TB 与传统检测方法的比较传统的结核分枝杆菌检测方法众多，包括结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核PCR检测等等，但受限于假阳性、假阴性率高，敏感性低，无法区分结核或非结核分支杆菌，操作繁琐实验室要求高等缺点，临床需求仍得不到真正满足。最新的结核分枝杆菌T-SPOT.TB检测是一项通过美国FDA认证，具有具有灵敏度高、特异性高等特点的检测手段，其检测结果不受接种卡介苗与否及免疫力功能是否正常等因素影响，是一项在全球获得广泛认可的结核快速诊断技术，在美国、欧洲等要求极为苛刻的国家和地区，甚至世界卫生组织均推荐其作为结核分枝杆菌测试的准则之一，并且入选多国结核病防治指南作为结核分枝杆菌诊断的标准。3.&&&&& T-SPOT.TB 准确、可信、快速的结核监测A快速:a已知最敏感的T细胞检测技术b最新的科技操作简单c血液检查，无需患者随访d可单人份实验，无试剂耗损e报告时间快f标本保存时间最长可达24~32小时B 可信：a应对各种不同免疫功能患者，均可以产生高质量结果b检测结果基本不受免疫抑制影响c非常低的灰区结果（需要重复试验患者）d国内外诊疗指南推荐e已知全球最精确的结核检测技术C 准确a特异性和灵敏度达95%b不受卡介苗接种影响c在移植患者试验中的高灵敏度和高特异性4.&&&&& 结果判读空白对照孔斑点数为0～5个且（抗原A或抗原B斑点数)-（空白对照孔斑点数）≥6 &&& 空白对照孔斑点数6-10个时且（抗原A或抗原B斑点数）≥2倍空白对照孔斑点数 &&& 如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时，检测结果为“阴性”。A阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。如出现以下情况 ，阴性结果不能排除结核杆菌的可能： 1、 因阶段不同（如标本是在细胞免疫发生前获取的）引起的假阴性结果； 2、少数免疫系统功能不全的情况，如HIV者、肿瘤患者、儿童等； 3、以及其它免疫学、实验非正常操作的差异。B阳性结果提示患者体内存在结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核。但是否为活动性结核病，需结合临床症状及其它检测指标综合判断。 &&& T-SPOT.TB结果不能作为单独或是决定性的诊断结核病的依据。 &&& 虽然ESAT-6和CFP10在所有的BCG菌株，以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但T-SPOT.TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌的引起的。&&附文：γ干扰素释放分析T-SPOT.TB诊断结核临床应用进展中国医学科学院：张丽帆, 刘晓清　　结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO估计, 全球有约20 亿人结核分枝杆菌,每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一, 结核导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。结核病的临床表现多样, 可以累积全身各个系统, 尤其是肺外结核病变往往十分隐匿, 给临床诊断带来极大的困难。结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)是长期以来用以快速诊断结核的唯一手段。然而TST 存在诸多缺陷: 在易受结核的免疫力低下人群中, 其敏感性反而大大降低; 结核菌素纯蛋白衍生物(purified prote in derivatives, PPD)是200多种蛋白的混合物, 其中很多是非结核分枝杆菌及卡介苗(Bacillus Calmette-Gurin, BCG)的共同抗原成分, 在普遍接种BCG 的地区造成非常高的“假阳性”率。此外, 皮试的操作和结果的解释存在主观依赖性, 降低了检查的准确性。T-SPOT.TB 是以特异性抗原为刺激源, 应用酶联免疫斑点技术(enzym e-linked mimunospot assay,ELISPOT)诊断结核的新方法。 　　结核分枝杆菌后机体的免疫应答根据结核的状态, 人群可以分为无结核、活动性结核、潜伏性结核和治愈。结核分枝杆菌是胞内寄生菌, 侵入机体后, 首先引起固有免疫反应, 被巨噬细胞吞噬。在大多数者中, 单纯的固有免疫并不足以抑制结核分枝杆菌的生长增殖。被的巨噬细胞凋亡后, 释放出大量特异性抗原,可被树突状细胞加工呈递给特异性的CD4、CD8和CDT 细胞, 以及CD1限制性T 细胞, 继而引发获得性免疫。CD4 T 细胞在结核免疫防御机制中发挥主要作用, 特异性的CD4 T 细胞与抗原肽-主要组织相容性复合体2类分子复合物结合后被激活, 分泌C干扰素, 从而激活巨噬细胞发挥抗结核活性。特异性CD8 T 细胞产生效应因子肿瘤坏死因子A和干扰素C并释放颗粒酶和穿孔素溶解细胞, 同时启动Fas途径发挥其溶细胞作用。γ干扰素是结核分枝杆菌后机体免疫应答中最重要的细胞因子。在大多数免疫力正常的者中, 获得性免疫能够控制却不足以清除结核, 吞噬了结核分枝杆菌的巨噬细胞被纤维包裹形成肉芽肿而使局限, 这时机体呈现一种无症状的潜伏性状态, 而结核特异性的中央型记忆细胞(CCR7+CD27+)和效应型记忆细胞(CCR7-CD27-)在机体中长期存在。潜伏性结核者一生中有10% 的可能发生结核病, 约5% 在两年内复发表现为活动性结核,另有5% 将在此后的时间内复发。由于潜伏者的体内长时间存留活菌, 当出现各种原因导致机体的免疫力低下时,结核复发的风险显著增加,如结核合并人免疫缺陷病毒(human mimunodeficiency virus,HIV)时, 发展为活动性结核的风险将增加至每年10%。 &T-SPOT.TB的原理及结果判断 　　T-SPOT.TB是以EL ISPOT 技术检测结核的新方法, ELISPOT 技术是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术, 是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一, 可以检测出1 /100 000~1 /50 000外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中经某种抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞, 经过酶联显色后, 通过ELISPOT分析系统(ELISPOT Reader)对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞, 从而计算出抗原特异性细胞的频率。T-SPOT.TB 的产生得益于基因分子生物学和免疫学的进展。1999年, Behr等应用基因芯片技术将结核分枝杆菌标准株H37Rv和BCG的全基因组进行比较, 结果显示129个只特定存在于结核分枝杆菌而在BCG中缺失的开放读码框, 这些在BCG中缺失的部分被划分为16个区域, 命名为RD1 ~RD16, 其中RD1 包含9个开放读码框(Rv3871 ~Rv3879 c), 被证实在所有的卡介苗菌株中均不存在,因此最具有编码特异性抗原的潜质。结核后体内长期存在抗原特异性的记忆性T 细胞, 当再次遇到抗原刺激时, 能迅速活化增殖, 释放γ干扰素。综合以上原理, 英国学者Lalvani 建立了以RD1 编码的结核特异性抗原6 kD早期分泌靶向抗原(early secreting antigen target-6, ESAT-6) 和10 kD培养滤过蛋白(culture filtrate protein-10, CFP-10)肽段库为刺激原, 检测外周血中结核特异性释放C干扰素的T淋巴细胞, 从而诊断结核的新方法。T-SPOT.TB2004年在欧洲、2005年在加拿大被批准使用, 美国FDA的审批在2008年完成。T-SPOT.TB是目前C干扰素释放分析诊断结核的最主要方法之一。 　　T-SPOT.TB的实验结果清晰, 易于判断。实验设有空白对照、阳性对照以及以ESAT-6 和CFP-10肽段库作为刺激原的两个实验孔。空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数大于20时视为实验有效。当空白对照孔内斑点数小于6时, 任一实验孔斑点数减去空白对照后大于等于6, 结果判为阳性; 当空白对照孔内斑点数大于6时, 任一实验孔斑点数大于空白对照的2倍, 结果判为阳性。T-SPOT.TB的实验结果用每106PBMCs中斑点形成细胞(spot forming cells, SFC s)的数目来描述, 即SFCs/106PBMCs。 T-SPOT.TB的临床意义 敏感性与特异性评价　　潜伏性结核的诊断无金标准, T-SPOT.TB 敏感性评价多在培养或病理阳性的活动性结核患者中进行。Pai等对近3 年的13项研究进行Meta分析, 这些研究共纳入726例受试者, 绝大多数是结核培养阳性、HIV 阴性的成年人, 分析表明T-SPOT.TB 的综合敏感性为90%。在免疫力低下的人群中, T-SPOT.TB依然能够维持较高的敏感性。Chapman等研究显示39例HIV阳性的结核患者中T-SPOT.TB的敏感性为90%, 而PPD 皮试的阳性率仅为72%。Liebeschuetz等报道了对293例怀疑结核的非洲儿童的随访结果, 这些儿童的平均年龄为3 岁, 约46% HIV 阳性, 多数合并营养不良, 对于确诊结核或高度怀疑结核的病例, T-SPOT.TB的阳性率为83%, PPD 皮试的阳性率为63%, 两者差异具有显著性(P&0.001)& span=&&&。数据分析显示年龄、HIV 状态和营养不良的严重程度对T-SPOT-TB结果无影响, 但均能导致PPD 皮试结果的显著差异。提示T-SPOT.TB 在免疫力低下的个体中具有更高的诊断效能。Nicol等在2009年发表了对243 例可疑结核的婴幼儿的研究结果,这些婴幼儿平均年龄为18个月, 在经痰或胃灌洗液结核菌培养阳性确诊的病例中, T-SPOT.TB 的阳性率仅为50%, 而年龄大于12个月的幼儿与12个月之内的婴儿相比, 前者阳性率明显增高, 提示在婴儿中诊断结核会降低T-SPOT.TB的敏感性。在肺外结核的诊断中, T-SPOT.TB 具有较高的敏感性。Ferrara等和Lee等报道的两个前瞻性研究中, 共包括18例肺外结核患者, T-SPOT.TB 的阳性率为100% 。Kmi 等随诊72例怀疑肺外结核患者的前瞻性研究显示, 对于活动性肺外结核, T-SPOT.T和PPD的敏感性分别为94%和47%, 二者比较差异具有显著性(P&0.001)& span=&&&。47% 的随诊对象合并有导致免疫低下的情况, 包括HIV 、肿瘤、移植、以及自身免疫病等, 可能是导致PPD皮试的阳性率显著降低的原因。T-SPOT.TB特异性评价的研究都在结核低流行区进行。Pai等的Meta分析中纳入了6项研究,其中5项中的受试者都常规地接受BCG免疫。6项研究共包括290名受试者, 93% 为无结核接触史的健康成年人, 其综合特异性为93%。 & 活动性结核与潜伏性结核的鉴别　　机体免疫力低下时, 免疫系统与结核菌之间的平衡被打破,结核菌得以大量复制, 从而导致结核活动。结核菌数量增加时被加工呈递的抗原也会增加, 因此被活化的抗原特异性效应T 细胞的数量也会随之增加,在T-SPOT.TB中反映为斑点数目的增加。基于上述原理, SFCs的数量有可能存在一个界值用来鉴别活动性结核和潜伏性结核。 　　Janssens等研究了T-SPOT-TB 在鉴别潜伏结核和活动性结核中的作用, 他们将潜伏结核定义为T-SPOT-TB阳性的无症状结核接触者。活动性结核患者在治疗2周内进行T-SPOT-TB 测试, 减少了治疗对检测的影响。T-SPOT.TB结果在活动性结核患者中显著高于潜伏性结核人群(P&0.0001)& span=&&&。受试者工作特征曲线分析显示以4915 SFCs为分界值鉴别活动性与潜伏性结核, 其敏感性为83%, 特异性为74% , 但两者间的交叉较大。Chee等对230例培养阳性活动性结核患者和183例结核接触者进行了T-SPOT.TB 检测, 在ESAT-6肽段库中, 活动性结核患者与结核接触者的SFCs数分别为108 vs140 SFCs /106PBMCs(P&0.001), 在CFP-10 肽段库中, 分别为148 vs1 52 SFCs /106PBMC s (P&0.001),& span=&&&但两者重叠区域较大。 　　潜伏性结核的斑点数有可能高于活动性结核, 因此T-SPOT.TB 难以区分活动性结核和潜伏性结核。其原因可能有两点: (1) 潜伏性结核者的免疫功能良好, 少量的抗原刺激就激发出活跃的保护性免疫; (2) 活动性结核患者免疫功能低下, 大量的抗原刺激也不足以激起有效的细胞免疫。T-SPOT.TB的斑点数虽然并不精确地与结核活动程度呈正相关, 但仍然存在着结核活动程度越高斑点数越多的趋势。 　　结核发病风险的预测 T-SPOT.TB 能否预测活动性结核对临床意义重大, 尤其在我国这样资源相对匮乏的高负担国家。准确诊断潜伏性结核者并对其进行选择性的预防性治疗, 可以更加合理地运用资源以及减少患者的负担和痛苦。Brodie等对56名涂阳密切接触者与40名无接触史者进行病例对照研究, 结果显示T-SPOT.TB阳性与密切接触具有更好的相关性, 比值比为219(P=0.03), 能更加准确地诊断潜伏性结核。Hesse-ling等对82名家庭密切接触者的横断面研究也得出了相似的结论。Bakir等对908名与涂阳患者接触过的儿童进行了为期3年的前瞻性研究,在381名T-SPOT.TB 结果为阳性的接触者中, 最终11 名发展成为活动性结核, 其发生风险是T-SPOT.TB阴性接触者的3186倍(P=0.024)。而且与TST 相比, 以T-SPOT.TB 为标准能够更加准确地锁定需要预防性抗结核治疗的者。T-SPOT.TB的斑点数越多, 发生活动性结核的可能性越大, 而且短期内有过结核接触史的患者T-SPOT.TB的斑点数较多时更有意义。此外, 对于T-SPOT.TB 阳性的人群, 定期的复查监测斑点数的变化是很有必要的。类似于TST, 如果T-SPOT.TB 的斑点数在短时间内显著增加, 则强烈提示体内结核活动, 此时给予预防性的治疗十分必要 。 　　综上, T-SPOT.TB 在诊断结核方面具有良好的敏感性和特异性, 在鉴别活动性结核和潜伏性结核、预测结核发病风险方面也具有一定意义,已被越来越多的国家认可并应用于临床诊断。基于结核抗原特异性T 细胞向病变部位集中的特点, T-SPOT.TB技术的检测物已不仅局限于静脉血, 支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外结核的诊断。在现有结核诊断方法存在诸多缺陷的今天, T-SPOT.TB可以给临床医师提供有力参考, 指导临床实践。 参考文献（略）
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