| 搜索：All productsHuman/Mouse/Rat ORF过表达克隆Human/Mouse/Rat ORF过表达病毒颗粒Human/Mouse/Rat shRNA克隆Human/Mouse/Rat shRNA病毒颗粒other ORF过表达克隆other ORF过表达克隆病毒颗粒miRNA抑制克隆miRNA抑制克隆病毒颗粒micoRNA前体过表达克隆micoRNA前体过表达克隆病毒颗粒other shRNA克隆other shRNA克隆病毒颗粒qPCR引物报告基因质粒报告基因慢病毒细胞因子其它报告基因细胞系细胞株载体系列&慢病毒&腺病毒&腺相关病毒&CRISPR/Cas9服务&课题服务&产品中心 > > >自噬指示体系-LC3质粒/慢病毒/腺病毒自噬指示体系-LC3质粒/慢病毒/腺病毒Search:
1.&&&&&&& GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。
2.&&&&&&& mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：
用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。&
pGM-CMV-GFP-hLC3&质粒
哺乳动物表达质粒
pGMLV-GFP-hLC3慢病毒
50ul*4管(&1E8TU/ml)
pGMLV-GFP-hLC3慢病毒
50ul*8管(&1E8TU/ml)
CMV-TurboRFP-EGFP-LC3-PGK-Puro&慢病毒
50ul*4管(&1E8TU/ml)
CMV-TurboRFP-EGFP-LC3-PGK-Puro&慢病毒
50ul*8管(&1E8TU/ml)
pGMAD-CMV-GFP-hLC3&腺病毒
100ul*5管(&1E10PFU/ml)
pGMAD-CMV-GFP-hLC3&腺病毒
100ul*10管(&1E10PFU/ml)
pGMAD-CMV-RFP-GFP-hLC3&腺病毒
100ul*5管(&1E10PFU/ml)
pGMAD-CMV-RFP-GFP-hLC3&腺病毒
100ul*10管(&1E10PFU/ml)
Copyright (C)
吉满生物有限公司 版权所有2016 年诺贝尔生理学或医学奖「发现细胞自噬机制」的原理是什么？带来的成就和影响有哪些？ - 知乎1309被浏览66579分享邀请回答17336 条评论分享收藏感谢收起您的位置：
自噬抑制药物氯喹联合索拉菲尼抑制肝癌细胞的实验研究
自噬抑制药物氯喹联合索拉菲尼抑制肝癌细胞的实验研究
Effect of sorafenib in combination with chloroquine on preventing HCC in vivo
发布时间：　　浏览量：116　　收藏数：0　　评论数：
丁振斌1，*，
史颖弘2，，
彭远飞1，，
1、复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海，200032；&&&&&&
2、 复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海，200032；
目的：研究小剂量氯喹（CQ）联合索拉菲尼（Sorafenib）的抑制肝癌细胞的效果，并探索其机制。方法：首先应用sorafenib干预三种肝癌细胞MHCC97-L、PLC/PRF/5和HepG2，应用annexinV/PI染色流式检测细胞凋亡，GFP-LC3转染及LC3 Western blot技术检测细胞自噬活性。应用自噬抑制剂3-MA、小剂量CQ或RNAi沉默Atg5的表达抑制自噬活性后，检测sorafenib诱导的MHCC97-L细胞凋亡。结果：Sorafenib能够诱导肝癌细胞凋亡，annexin V阳性细胞显著增加，且具有浓度及时间依赖趋势。在sorafenib诱导细胞凋亡的同时，我们发现细胞内的自噬相关蛋白Atg5、Beclin 1均随着时间的延长表达逐渐增加。自噬标记性蛋白LC3-II在药物作用6h后即显著高表达。Sorafenib干预GFP-LC3转染后的细胞，6h后即出现大量点状荧光聚集，提示自噬小泡的形成增加。而后我们发现通过3-MA、小剂量CQ或RNAi沉默Atg5的表达抑制自噬可以增强sorafenib诱导的细胞凋亡。结论：CQ通过抑制自噬的降解机制可以促进sorafenib诱导的肿瘤细胞凋亡，增强sorafenib的抑瘤作用。自噬作为细胞的一种保护性机制，可以保护肿瘤细胞逃避药物诱导的凋亡。
关键词1；自噬2；肝细胞癌3；凋亡 4；氯喹 5；索拉菲尼
DING Zhenbin1,*，
SHI Yinghong2,，
PENG Yuanfei2,，
SONG Kang2,
1、 Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, 200032；&&&&&&
2、Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, 200032；
Abstract：
Purpose: To investigate the effect of sorafenib in combination with low-dose chloroquine (CQ) on HCC, and explore the underlying mechnism to provide a new route to improve the effect of HCC chemotherapy. Methods: MHCC97-L, PLC/PRF/5 and HepG2 cells were treated with sorafenib at different concentrations and differnt time courses. The extent of cell apoptosis was routinely assessed by annexin V/PI staining. The autophagic activity was determined by GFP-LC3 redistribution and LC3 Western blot. Then the autophagic activity was inhibited by silencing atg5, 3-MA or low-dose CQ, and the apoptosis induced by sorafenib was assessed again. Resuls: Sorafenib can induce apoptosis of HCC cell lines. And the annexin V-positive cells increased significantly with the concentrations and time courses of sorafenib treatment. Meanwhile, the expression of autophagy-related protein atg5 and beclin 1 also increased in the sorafenib treatment. LC3-II was found in a high level after 6 hours treatment of sorafenib. Moreover, after these cells were transfected with GFP-LC3, sorafenib treatment resulted in a large amount of punctuate fluorescence sites in cells and massive induction of GFP-LC3-positive cells. These results indicated that sorafenib induced the fromation of autophagosomes. Then, the accelerated apoptosis induced by sorafenib was found after the autophagy was inhibited by silencing Atg5, 3-MA or low-dose CQ. Conclsion: Low-dose CQ can enhance the apoptosis induced by sorafenib in HCC, through the inhibition of autophagic degradation. Autophagy may be a survival mechanism avoiding apoptosis induced by chemotherapy, once a tumor is formed.
Keywords：
HCC; sorafenib
PDF全文下载：
&&&&（64）
作者简介：
丁振斌（1981），男，主治医师，主要研究方向：肝癌复发转移及治疗
通信联系人：
【收录情况】
中国科技论文在线：丁振斌，史颖弘，彭远飞等.&自噬抑制药物氯喹联合索拉菲尼抑制肝癌细胞的实验研究[EB/OL].北京：中国科技论文在线&
[].http://www./releasepaper/content/.
发表期刊：
首发论文搜索
&> 信息科学与系统科学
&> 地球科学
&> 畜牧、兽医科学
&> 基础医学
&> 临床医学
&> 预防医学与卫生学
&> 军事医学与特种医学
&> 中医学与中药学
&> 工程与技术科学基础学科
&> 测绘科学技术
&> 材料科学
&> 矿山工程技术
&> 冶金工程技术
&> 机械工程
&> 动力与电气工程
&> 能源科学技术
&> 核科学技术
&> 电子、通信与自动控制技术
&> 计算机科学技术
&> 化学工程
&> 纺织科学技术
&> 食品科学技术
&> 土木建筑工程
&> 水利工程
&> 交通运输工程
&> 航空航天科学技术
&> 环境科学技术
&> 安全科学技术
&> 图书馆、情报与文献学
&> 体育科学
尊敬的作者，欢迎您在本站投稿：
注：请投稿作者直接在本站注册并登录提交文章，
任何个人或机构宣称代理在本站投稿均为侵权行为
本学科今日推荐
本文作者合作关系
本文相关论文
外科学器官移植外科学临床医学其他学科感染性疾病学肿瘤治疗学
&&&&&&&&&&&&&&
中国科技论文在线
&|&&|&&|&&|&&|&nbsp
临床诊断学
耳鼻咽喉科学
临床医学其他学科
自噬抑制药物氯喹联合索拉菲尼抑制肝癌细胞的实验研究
&&收藏本文
&&推荐本文给好友
&&订阅本文所在学科
&&分享到我的圈子
多个邮箱请用逗号“，”隔开
分享到我的圈子扫一扫进入手机商铺
成立时间：2010年
入驻丁香通年限：8年
商家等级：金牌客户
产品信息完整度：41%
微信扫一扫关注公众号
【自噬及其研究方法】-汉恒生物
发布时间： 17:37&|&
点击次数：
自噬及其研究方法概述自噬（Autophagy）及其研究方法概述一、背景概念:目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy 和Chaperone-mediatedautophagy CMA), 大自噬（Macroautophagy） 即我们说的自噬（ autophagy） ;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy.自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬的步骤可以大概总结为下面四步:步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2 层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。步骤2：Phagophore 不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2 个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2 者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬及其研究方法概述自噬的特性：1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。2）自噬过程很快，被诱导后8min 即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h 后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。3）自噬的可诱导特性：表现在2 个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来自噬过程的调控：从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前，已经自噬及其研究方法概述上海市徐汇区斜土路1175 号 E-mail:Tel：021- http://www.hanbio.net实验室地址：上海市浦东新区张江高科技园区 蔡伦路720 弄药谷孵化器1 号楼314- 160 -报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA 损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：抑制类1）Class I PI3K pathway （PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS (Insulinreceptor substrate) 结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）mTOR 在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associatedprotein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化,rapamycin 是最典型最常用的自噬激动剂.激活类1）Class III PI3K结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。3-MA 是Class III PI3K 的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂.二、自噬的研究方法：汉恒生物已开发并完善了多套自噬相关的研究体系和工具,并积累了丰富的自噬研究经验。正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：（一）自噬诱导剂1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）3）Earle's 平衡盐溶液：制造饥饿4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制剂5）Rapamycin：mTOR 抑制剂(这是最常用的)6）Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂（二）自噬抑制剂1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA 干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：1）观察自噬体的形成由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3 等融合蛋白来示踪自噬形成：(常用)GFP-LC3 单荧光指示体系：由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。我们利用LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3 指示技术：无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。汉恒生物已开发出高效的评价用GFP-LC3 病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评价自噬流。双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品。mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。自噬及其研究方法概述我们在显微镜成像后红绿荧光merge 后通过merge 后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3 病毒后给予氨基酸剥夺处理2 小时后出现明显增强的自噬以及自噬流。自噬及其研究方法概述3）利用Western Blot 检测LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成（LC3 抗体购自sigma，L8918）。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。（Note：LC3 抗体对LC3-II 有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2 和3 需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是seletively降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是蛋白p62, p62 is selectively incorporated into autophagosomesthrough direct binding to LC3 and is efficiently de thus, thetotal cellular expression levels of p62 inversely correlate with autophagic activity.(p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系)自噬及其研究方法概述上海市徐汇区斜土路1175 号 E-mail:Tel：021- http://www.hanbio.net实验室地址：上海市浦东新区张江高科技园区 蔡伦路720 弄药谷孵化器1 号楼314- 164 -三、自噬与肿瘤的关系：与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。如Atg-5 缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，有利于细胞的存活。鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处：1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件.由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K 信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括 Beclin 1 在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。