一高速离心机hnlixinji上清里是不是就很少了，我跑sds

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-30 03:37 标签： 离心机价格hnlixinji
跑SDS-PAGE蛋白大小不对 - 实验交流 - 生物秀
标题: 跑SDS-PAGE蛋白大小不对
摘要: [跑SDS-PAGE蛋白大小不对] 我表达的重组蛋白，大小大概10kD左右，标签大概6 6kD，所以加起来应该是十几kD的样子。结果我跑SDS-PAGE明显表达的大小约为25kD不到一点，请各位帮我分析一下是怎么回事？ 关键词:[分子量 抗体 目的蛋白 SDS-PAGE 疏水性 氨基酸组成 特异抗体]……
我表达的重组蛋白，大小大概10kD左右，标签大概6.6kD，所以加起来应该是十几kD的样子。结果我跑SDS-PAGE明显表达的大小约为25kD不到一点，请各位帮我分析一下是怎么回事？回复SDS-PAGE显示的分子量通常称为表观分子量（apparent MW),表观分子量与基于氨基酸组成推算的理论分子量通常会有差别，主要是由于蛋白表达时的翻译后修饰有关，有时与氨基酸组成也影响表观分子量。进一步的验证表达的蛋白是否为你的目的蛋白，可以纯化后进行蛋白的C端及N端测序分析，或者进行western验证等回复补充一下：一般跑蛋白电泳出现大小有不同，不就是和分子内和分子间二硫键以及蛋白质聚集、降解有关系吗？但是这个20多kD的结果感觉那种情况都套不上去啊，谁能帮我具体的分析一下可能是怎么回事呢？实在不行我就去打个质谱看看具体多少分子量了。回复
SDS-PAGE显示的分子量通常称为表观分子量（apparent MW),表观分子量与基于氨基酸组成推算的理论分子量通常会有差别，主要是由于蛋白表达时的翻译后修饰有关，有时与氨基酸组成也影响表观分子量。进一步的验证表达的 ... 正在做western，但是可能是分子量比较小，一直转膜不成功回复如果构建没有问题的话，感觉和蛋白质的修饰有关系。。还有就是我感觉ladder在不同浓度的胶上面指示的大小感觉还是有区别。。回复目的蛋白的亲水性如何？蛋白marker的大小也不是完全准确的，尤其是目的蛋白疏水性强的话，变性不如marker好，和marker在特定的胶里跑得不一样的可能性很大。这就是所谓的表观分子量和理论分子量有时候区别比较大。回复
目的蛋白的亲水性如何？蛋白marker的大小也不是完全准确的，尤其是目的蛋白疏水性强的话，变性不如marker好，和marker在特定的胶里跑得不一样的可能性很大。这就是所谓的表观分子量和理论分子量有时候区别比较大。 很有可能是这个原因，目的蛋白本身疏水性是比较强的，但是这个大小会差多少呢？目的蛋白才10kD，加上标签也才17kD不到，结果就差不多差出去１０kD去了。。。:rol:回复
如果构建没有问题的话，感觉和蛋白质的修饰有关系。。还有就是我感觉ladder在不同浓度的胶上面指示的大小感觉还是有区别。。 这个蛋白肯定是二级结构还没有完全打开的，我就是纠结怎么会差这么多。。。ladder的差别倒是计算在内了回复
很有可能是这个原因，目的蛋白本身疏水性是比较强的，但是这个大小会差多少呢？目的蛋白才10kD，加上标签也才17kD不到，结果就差不多差出去１０kD去了。。。:rol:... 疏水性蛋白是最难说的，有时候可以差到20kD呢。当然这也要具体情况具体分析。顺便问下你用的是什么标签？确定是6.6kD?回复
疏水性蛋白是最难说的，有时候可以差到20kD呢。当然这也要具体情况具体分析。顺便问下你用的是什么标签？确定是6.6kD?... 能差这么多啊！是PET32b的标签，普通的His标签，但整个标签算起来大概是这么大:rol:回复
能差这么多啊！是PET32b的标签，普通的His标签，但整个标签算起来大概是这么大:rol:... 只His-tag没那么大吧，6个His，分子量大约为110×6=660kDa，pET32还带了个Trx标签增强表达蛋白水溶性的。那个有109AA, 分子量大约为12kDa。所以我觉得你蛋白跑到23kDa是正常分子量。回复
只His-tag没那么大吧，6个His，分子量大约为110×6=660kDa，pET32还带了个Trx标签增强表达蛋白水溶性的。那个有109AA, 分子量大约为12kDa。所以我觉得你蛋白跑到23kDa是正常分子量。... 一不小心说错了。。。是PET-30b:o回复
一不小心说错了。。。是PET-30b:o... 那会不会是二聚体呢？你的样品有没有加巯基乙醇或者DTT？回复pET32b的话如果带Trx标签及各种切位点以及S-tag怎么可能才6.6kD，差不多快150，160个氨基酸了，怎么可能6.6KDa？？？:shuai:回复
那会不会是二聚体呢？你的样品有没有加巯基乙醇或者DTT？... 最近跑出来的变成19kD了。。。:rol:做WESTERN也做不出来，急死人了，我打算看看能不能打个谱算了回复
pET32b的话如果带Trx标签及各种切位点以及S-tag怎么可能才6.6kD，差不多快150，160个了，怎么可能6.6KDa？？？:shuai: 是30b，之前不小心说错了:P回复
最近跑出来的变成19kD了。。。:rol:做WESTERN也做不出来，急死人了，我打算看看能不能打个谱算了... 你做Western用的是蛋白特异抗体还是his-tag抗体呢？是都不行么？回复
你做Western用的是蛋白特异抗体还是his-tag抗体呢？是都不行么？... 是His的抗体，蛋白特异抗体怎么找啊，我那个蛋白不是常见的蛋白回复
是His的抗体，蛋白特异抗体怎么找啊，我那个蛋白不是常见的蛋白... 你确定抗体没问题吗。有的公司的His抗体不怎么好使。蛋白特异性抗体可以让做。回复
你确定抗体没问题吗。有的公司的His抗体不怎么好使。蛋白特异性抗体可以让做。... 抗体没有问题，之前用这个载体表达另一个40多kD的蛋白就做出来了。交给外面的公司做？那是不是提供自己的序列就OK了啊？是不是很贵？
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电话：021-为什么我的SDS-PAGE胶 跑出来考染是一条蓝带呢?没有特别明显的条带呢?marker有清楚的带啊?我把菌液沉淀用100微升DDH2O悬的，然后超声，我跑的是超声后的菌液和超声后菌液离心的上清。加入等体积的2×SDS上样缓冲液。点15微升。
°迷岛yywj
很怀疑用超声能不能裂解完全,最好还是买个细胞裂解液吧
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Tricine-sds-page电泳要怎么跑？帮我分析一下结果啊。
我用的是nature 的protocol，但是为什么每次跑出来，小分子仍然分不开呢？10KD以下都没有条带。
我用的是16%T、3%C的胶，加或不加尿素我都试过。都一样，10KD以下跑不出条带来。是什么原因？
注：最小的那个黄色marker是10KD。
130111 Tricine-SDS-PAGE电泳（无尿素）.JPG
我跑的是E.coli诱导表达的上清和沉淀。按道理，应该有很多小分子条带啊。
只是看看带型分布不必用tris-tricine胶吧。如果目的蛋白分子量小自然另当别论。
我的目的蛋白只有6KD，所以才用Tricine 的。
如果你是在大肠杆菌里诱导表达的话，应该可以诱导出明显的带，不用tricine胶也应该能看到。我觉得你目前正在检测诱导条件，直接上普通的16%胶就可以了。注意不要把前沿跑出去了。当然，Tricine胶的确是分离效果好。只是这样也不知道你的胶的问题在哪里。我觉得是不是有溶液配得不对，检查一下3×gel buffer的pH是否调得正确。Tris加浓盐酸会产热，先调到大概，然后等溶液冷却后再继续调至所需pH。还有就是丙烯酰胺溶液中的丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺比例。我是配成48:15%的stock。
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随时随地聊科研SDS-PAGE电泳怎么使MARK跑的更重直点,同时使样品分离的更开一点了我跑的是50V1个小时,200V40分钟,机器是别人设定的我做的是细菌胞外蛋白，就是细菌培养基离心后用上清浓缩后点样的
yaofen00034
一楼的解答真是匪夷所思.胶是倒进去的,只要不过凉,怎么会不均匀?再者page的胶板就那么大,你让楼主到哪找大板子?再者跑的时间要长?电压要高?那不是跑出去了么?1,让marker跑直很简单,把marker点在中间的槽子就行了.2,你分离胶跑的电压调低点,别用200V,电压高了也歪3,不一定就是40分钟,随时观察溴酚蓝跑的位置,溴酚蓝快要跑出胶的时候停就行4,降低胶的浓度,可以让蛋白迁移更快,分散加强.
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想让mark跑得直 胶一定要制的均匀 想让样品分开 用大胶板 跑的时间长一些（当然为保证速度电压也要设得高一些） 就是为了让蛋白跑的距离更长（当然样品要事先变性）
1、让MARK跑直，要注意空白孔（就是胶上没有加样的多余孔道）也要加一定量的1X蛋白上样缓冲液，量多少取决于你蛋白加样量，这样能保持整个孔道的重量大体平衡，跑的时候能成一条直线2、我的习惯是浓缩胶80V，只有一条线即可，分离胶120V，这样蛋白能充分跑开3、一楼说的对，分离胶在制备的时候要注意均匀，凝固的时候线不能斜，否则你怎么跑都是歪的，我用无水乙醇封闭的时候，会摇晃下，这样...
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