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求助引物设计：前前后后三次都有问题，请大神帮帮忙…………感激不尽
共1067bp， 粗线是我需要看的基因区域，想设计一对引物，普通PCR后测序（单向测，所以上游或者下游引物离目标区域起码60bp），用primer或者NCBI primer blast设计了三次，每次引物特异性较差或者退火温度摸不出来。
下面是我的序列：
TGAGACTTTT CCGTTGCCGC TGGGAGCCGG AGGCGCGGGG ACCTCTTGGC GCGACGCTGC
CCCGCGAGGA GGCAGGACTT GGGGACCCCA GACCGCCTCC CTTTGCCGCC GGGGACGCTT
GCTCCCTCCC TGCCCCCTAC ACGGCGTCCC TCAGGCGCCC CCATTCCGGA CCAGCCCTCG
GGAGTCGCCG ACCCGGCCTC CCGCAAAGAC TTTTCCCCAG ACCTCGGGCG CACCCCCTGC
ACGCCGCCTT CATCCCCGGC CTGTCTCCTG AGCCCCCGCG CATCCTAGAC CCTTTCTCCT
CCAGGAGACG GATCTCTCTC CGACCTGCCA CAGATCCCCT ATTCAAGACC ACCCACCTTC
TGGTACCAGA TCGCGCCCAT CTAGGTTATT TCCGTGGGAT ACTGAGACAC CCCCGGTCCA
AGCCTCCCCT CCACCACTGC GCCCTTCTCC CTGAGGACCT CAGCTTTCCC TCGAGGCCCT
CCTACCTTTT GCCGGGAGAC CCCCAGCCCC TGCAGGGGCG GGGCCTCCCC ACCACACCAG
CCCTGTTCGC GCTCTCGGCA GTGCCGGGGG GCGCCGCCTC CCCCATGCCG CCCTCCGGgc
tgcggctgct gcCgctgctgcta ccgctgctgt ggctactggt gctgACGCCT GGCCGGCCGG CCGCGGGACT
ATCCACCTGC AAGACTATCG ACATGGAGCT GGTGAAGCGG AAGCGCATCG AGGCCATCCG
CGGCCAGATC CTGTCCAAGC TGCGGCTCGC CAGCCCCCCG AGCCAGGGGG AGGTGCCGCC
CGGCCCGCTG CCCGAGGCCG TGCTCGCCCT GTACAACAGC ACCCGCGACC GGGTGGCCGG
GGAGAGTGCA GAACCGGAGC CCGAGCCTGA GGCCGACTAC TACGCCAAGG AGGTCACCCG
CGTGCTAATG GTGGAAACCC ACAACGGTGA GCTCGGAGGG GCAGGGGAGC CGGGAGGGGG
GCCCCCAGGG GGCGCCGGAG TGCCGGGGCC ACGGGTAGGA AGTGACTGGC AGAAGAAACT
GGCTGGAGGA AGAGGACACC CCGGGGCAAA GGGA
回复，很感谢，但是我看了您设计的结果，因为粗线是我要看的目标区域，可您设计的好像是338bp，我的目标区域没有包括全哦。还是很谢谢:hand:
我在分析下，好像看错了。呜呜，我blast下:D
我在分析下，好像看错了。呜呜，我blast下
是黑体的，好像我弄错了。:victory:
好的，我就直接合成引物了，谢谢您，然后pcr之后测序。我前面自己设计的结果blast都还不错，但是退火温度从45-65℃摸，就是不行。因为刚才用您的引物blast没成功，不知道是不是我哪里弄错了。
外科的，在读博。
但有一点哦，你上面给的是基因组序列就没问题。一般情况下不怎么用blast；不会有问题；
单如果你给的cDNA或者mRNA之类的，就不行哦。
要是你扩增不出来，告诉我下，我给你个程序，基本没问题。
您看我的用primer blast和blastn的结果
QQ图片12.jpg
QQ图片57.jpg
QQ图片46.jpg
我想想就是
慢慢来，既然你选了分子，有问题的时候，刚好我空，可以给我站内信，你我这么盖楼，很不礼貌的了
F1(20bp)：GACGGATCTCTCTCCGACCT
R1（21bp）：CTTCACCAGCTCCATGTCGAT
F1：GCGCCCATCTAGGTTATTTCCG
R1：CCAGCCAGTTTCTTCTGCCAGTC
常规的设计的过程我都懂，这个基因把我搞的头都大
不盖楼了哈
给你站内消息了
好的。问一句，如果用你的引物是不是按照常规的也可以？
你这个基因扩增难度在于buffer；和引物关系不是特别大；
我上面的引物没有了你单条引物的而具体，彼此的Tm比较接近；从参数来说，会好一些。
好的，那我买GC高的buffer基本上没问题吧，您说的条件我们实验室很难，只有一台普通pcr仪器
就是在普通的PCR仪器上可以实现的。
你用的什么PCR仪器呢？
以前最古老的红色的那种，不知道型号啊。我的意思是，如果您设计的可以用GC高的buffer我就直接这么搞，或者我的引物也可以的话。
条件有点差，见谅啊
普通的PCR仪就可以，你目前用的肯定可以的
就是需要增加步骤而已；
那我就先用我的引物按照您站内的步骤试试吧？:D
可以，如果还出不来，你给我消息就好了
这个片段要扩增多少个sample?
200个sample啊，所以…………
谢谢，明天我会去试试，可能是目的序列GC含量的问题，GC含量太高了
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