脂质体作为干扰素-α载体的研究--《浙江大学》2003年硕士论文
脂质体作为干扰素-α载体的研究
【摘要】：干扰素是机体免疫细胞产生的一种细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗增殖和免疫调节机能等生物学活性。常规给药需频繁注射，常常会引起一系列不良反应，而且治疗费用也较高。脂质体具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮细胞吞噬，能激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体作为干扰素的载体，能改变干扰素的药动学性质、组织分布以及增加干扰素的吸收。由于干扰素是水溶性的大分子药物，所以制备的脂质体包封率低，而且在制备的过程中受有机溶剂的影响而活性降低。本课题的目的就是要研究一种制备工艺简单，避免干扰素直接与有机溶剂的接触，保持其生物学活性，适合进一步大规模生产的干扰素前体脂质体的制备方法，通过工艺和处方优化，使制备的干扰素脂质体包封率高，稳定性好，并进一步研究其体内动力学和组织分布。通过对干扰素脂质体的研究，为生物大分子药物脂质体给药系统的开发提供一种新的工艺方法。
本研究采用均匀设计法筛选最佳处方，粉末床研磨法制备空白前体脂质体，与干扰素-α混合得到干扰素-α脂质体；透射电子显微镜观察脂质体粒子形态；库尔特粒子分析仪测定粒子大小和分布；凝胶过滤法和超滤膜分离纯化脂质体；酶联免疫方法(ELISA)进行干扰素体内外分析；用氧化率评价脂质体的化学稳定性；气相色谱法检测脂质体乙醚残留检测；考察脂质用量、胆固醇与大豆磷脂的比例、载体粒子大小对水化后形成脂质体的平均粒度的影响；考察不同分离方法、类脂用量、胆固醇与大豆磷脂比例、电荷比例对脂质体的包封率的影响；通过放置时间对脂质体粒径和包封
研究生:叶志伟
导师:梁文权
率的影响、泄露率以及凝聚动力学试验三种方法考察脂质体的物理稳定性;考察冻融
过程中乳糖浓度对干扰素一Q脂质体的包封率及粒子大小和分布的影响;进行干扰素-
。脂质体的溶血试验;以高、中、低三种剂量小鼠尾静脉注射干扰素一Q脂质体和空
白脂质体，进行急性毒性试验;用大鼠尾静脉注射干扰素一Q溶液和干扰素一Q脂质体
研究其药代动力学;用小鼠尾静脉注射干扰素一。溶液和干扰素一Q脂质体，测定组织
中药物浓度，研究其组织分布，用3P87软件进行药动学数据处理。
研究结果表明，用ELISA法测定体内外的干扰素的蛋白含量，操作方便，方法
重现性好，回收率稳定，准确性高，特异性好，其灵敏度高。心、肝、肾、脾、肺各
组织和血清的干扰素一。回收率大于94%，RSD为1 .4%，最低检测为10P岁ml。前体
脂质体制备的最佳条件:保护剂为山梨醇，保护剂与脂质的质量比为5:1，十八胺
和脂质的质量比为1:9，磷脂与胆固醇质量比为9:1。制备所得的干扰素一Q脂质体
的粒径大小为80.8士36nm，包封率为68.2士4.5%。类脂的用量，膜材组成比例对干
扰素一Q脂质体的粒度基本没有影响，但是载体材料的颗粒大小有一定的影响。当载
体材料预先经过100目筛网处理以后，制备所得的前体脂质体水化后形成的脂质体的
粒子大小基本恒定。类脂的用量以及十八胺的用量对于脂质体包封率的影响较大，其
包封率随着用量的增加而增加。制备所得的脂质体乙醚残留量低于23.8p留g，符合
制剂生产的要求。脂质体中磷脂的氧化率仅为0.607士0.034%，氧化指数小于0.2，
符合规定。水化后所得的干扰素一Q脂质体在四小时内，泄漏量较少。热凝聚实验表
明冻融后的脂质体活化能从冻融前的29.92kJ/mol增加到104.犯kJ/mol，稳定性
提高，当乳糖浓度为1%时，经过冻融的脂质体的包封率可以达到68%左右。前体
脂质体在4℃冰箱中保存半年，粒子大小和水化后所得的干扰素一Q脂质体包封率基
本没有变化。制备的前体脂质体水化后形成的干扰素一Q脂质体不溶血;急性毒性试
验显示，干扰素一Q脂质体和空白脂质体没有毒性。动物研究显示，大鼠尾静脉注射
干扰素一。溶液和干扰素一。脂质体后，血药浓度曲线都符合二室模型，干扰素一。溶液
和干扰素一a脂质体的分布相半衰期Tl。。分别为“.15士1.36min和48.35士1.06min，
消除相半衰期Tl几p分别为1286.n士171.23和676.59士52.54，表观分布容积分别为
11.4土0.2 ml和14.0士0.3 ml，药时曲线下面积分别为17.27n岁ml·min
脂质体作为干扰素·Q载体的研究
和.97 ng/ml·min，两者的相对生物利用度为205.92%，统计矩方法分
析其MRT分别为692.31士117.9 min和293.02士21.23 min。小鼠的组织分布研究表明，
与干扰素一。水溶液组相比，静脉注射干扰素一Q一脂质体后，在肝、脾、肾、肺、心中
干扰素的分布分别是对照组的2.5倍、1 .7倍、0.78倍、1.11倍和0.94倍。干扰素-
。水溶液静脉注射后在肝和脾中的分布百分率分别为巧.2%和21.1%;干扰素一Q-
脂质体静脉注射后在肝中的分布百分率分别为28.4%和27.1%，是干扰素一a水溶液
的1 .9倍和1.3倍。干扰素一a一脂质体在肝脾等组织中的分布比千扰素一。水溶液高，
同时也改变了干扰素在肾脏的分布。
本研究建立了粉末床研磨法制备空白前体脂质体的新方法，前体
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2003【分类号】：R94【目录】：
中文摘要8-11
Abstract11-14
第一部分 干扰素-α脂质体的理化性质研究17-40
一、 材料和仪器17
(一) 试剂17
(二) 仪器17
二、 实验方法17-22
(一) 磷脂的精制17-18
1 磷脂的提纯17-18
2 大豆磷脂氧化的研究18
(二) 干扰素-α脂质体的制备工艺18-19
1 粉末床研磨法制备干扰素-α脂质体18
2 高速分散-冻融法制备干扰素-α脂质体18-19
(三) 干扰素-α脂质体的性质研究及质量评价19-22
1 脂质体乙醚残留检测19
1.1 气相色谱条件19
1.2 标准曲线的制备19
1.3 脂质体样品的乙醚残留19
2 干扰素-α脂质体的基本形态19
3 干扰素-α脂质体的粒子大小及分布19
3.1 LS-230库尔特粒度分析仪测定19
3.2 浊度的测定19
4 在冰冻状态下脂质体pH值的测定19-20
5 干扰素-α脂质体包封率的测定20-21
5.1 ELISA试剂盒测定干扰素浓度20
5.2 柱分离法20-21
5.2.1 Sephadex G-75柱20
5.2.2 干扰素-α脂质体的纯化20
5.2.3 包封率的测定20-21
5.3 超滤膜分离法21
5.3.1 超滤膜对脂质体的截留率21
5.3.2 干扰素-α的回收率21
5.3.3 包封率的测定21
6 干扰素-α脂质体的稳定性21-22
6.1 放置时间影响21-22
6.2 泄漏率22
6.3 凝聚动力学试验22
三、 结果与讨论22-40
(一) 脂质体乙醚残留量22-23
1 乙醚气相色谱图22-23
2 乙醚气相色谱标准曲线23
3 脂质体中的乙醚残留量23
(二) 大豆磷脂精制和氧化率23-24
1 大豆磷脂的性状23-24
2 大豆磷脂的氧化率24
(三) 粉末床研磨法制备所得干扰素-α脂质体的基本形态和性质24-34
1 脂质体水化前后显微形态观察24
1.1 前体脂质体的性状24
1.2 透射电子显微镜观察24
2 脂质体的性质24-34
2.1 水化后形成的脂质体的粒径分布24-26
2.2 脂质体平均粒度的影响因素26-28
2.2.1 脂质用量对脂质体平均粒度的影响26
2.2.2 胆固醇与大豆磷脂的比例对脂质体平均粒度的影响26-27
2.2.3 载体粒子大小对脂质体的平均粒度的影响27-28
2.3 干扰素-α脂质体的包封率及影响因素28-34
2.3.1 ELISA试剂盒测定干扰素-α蛋白含量28
2.3.2 柱分离法对脂质体的纯化28-29
2.3.3 超滤膜过滤法对脂质体的纯化29-30
2.3.4 不同分离方法对测定脂质体包封率的影响30-31
2.3.5 类脂用量对水化后形成脂质体包封率的影响31-32
2.3.6 胆固醇与大豆磷脂比例对包封率的影响32
2.3.7 电荷比例对脂质体的包封率的影响32-34
(四) 冻溶法制备干扰素-α脂质体及其影响因素34-36
1 乳糖浓度对干扰-α脂质体包封率的影响34-36
2 不同浓度乳糖冻融对干扰素-α脂质体浊度的影响36
(五) 干扰素-α脂质体的稳定性36-40
1 放置时间对脂质体的稳定性影响36-37
1.1 放置时间对粒径的影响37
1.2 放置时间对脂质体包封率的影响37
2 泄漏率37-38
3 凝聚动力学试验38-40
第二部分 干扰素-α脂质体的制备工艺的优化40-48
一、 试剂与仪器40
(一) 试剂40
(二) 仪器40
二、 实验方法40-44
(一) 均匀设计法实验设计40-43
(二) 结果及数据处理43-44
三、 结果44-46
(一) 方差分析44
(二) 模型分析44-45
(三) 逐步回归方程45
(四) 残差统计45-46
四、 讨论46-48
第三部分 干扰素-α脂质体的药动学和体内分布研究48-62
一、 实验材料48
(一) 试剂48
(二) 仪器48
(三) 动物48
二、 实验方法48-51
(一) 安全性试验49-50
1 溶血试验49
2 急性毒性试验49-50
2.1 药物、剂量和给药途径49-50
2.2 观察项目和方法50
(二) 血液和组织中干扰素含量的ELISA分析方法50-51
1 生物样品的前处理及药物含量的测定50
1.1 血清样品50
1.2 组织样品50
2 ELISA试剂盒测定干扰素的标准曲线50-51
3 回收率51
(三) 血药浓度51
(四) 体内组织浓度51
三、 结果与讨论51-62
(一) 安全性试验51-54
1 溶血试验51
2 干扰素-α脂质体及其空白脂质体的急性毒性试验51-54
2.1 行为特征51-52
2.2 死亡情况52
2.3 体重变化52-53
2.4 小鼠自主活动53-54
(二) EIA分析方法54
(三) 血清和组织样品回收率54-55
(四) 大鼠体内药动学研究55-58
1 大鼠尾静脉注射血药浓度-时间曲线55-56
2 药动学模型拟合56-57
3 统计矩方法分析57-58
(五) 干扰素-α和干扰素-α-脂质体在小鼠体内分布58-62
1 各组织中干扰素-α的浓度58-59
1.1 静注干扰素-α溶液的各组织中干扰素-α的浓度58-59
1.2 静注干扰素-α脂质体的各组织中干扰素-α的浓度59
2 统计矩方法分析59-62
2.1 静注干扰素-α溶液组统计矩方法分析59-60
2.2 静注干扰素-α脂质体组统计矩方法分析60
2.3 各组织中的分布百分率和相对摄取率60-62
第四部分 结论62-63
参考文献63-67
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