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Biomics CRISPR Cas9 基因敲除技术
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你可能喜欢sgRNAcas9软件图形用户界面开发及应用--《遗传》2015年10期
sgRNAcas9软件图形用户界面开发及应用
【摘要】：CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术是新一代功能强大的基因修饰技术。然而,脱靶效应(Off-target effects)是目前CRISPR/Cas9技术面临的最大问题。因此,设计脱靶风险低的sg RNA(single guide RNA)就成为关键。sgRNAcas9是一款专门用于sg RNA设计和评估脱靶效应的软件包。针对其核心运行程序,我们利用Java程序语言开发了其图形用户界面。此外,依据脱靶位点碱基数和sg RNA种子序列(seed sequences)的特异性,通过设置不同的风险等级对sg RNA的脱靶效应进行评估。随后,利用此软件设计了34 124条靶向人、小鼠、大鼠、猪和鸡中共4691个micro RNA(miRNA)前体的sg RNAs。此外,随机挑选了一个靶向人mi R-206前体的sg RNA进行脱靶效应评估和验证。结果发现,sgRNAcas9软件人机交互界面友好,大多数miRNA前体可通过该软件寻找到sg RNA,且他们的GC%含量范围集中于40%~60%。利用sgRNAcas9软件设计的靶向mi R-206的sg RNA,其基因组编辑活性和脱靶位点可被实验验证。本研究表明sgRNAcas9图形用户界面软件能针对任意物种设计特异性的sg RNA,其可在Bioo Tools(/)网站下载。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：Q78;TP311.52【正文快照】：
基于CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)/Cas9系统的基因组编辑技术来源于细菌获得性免疫,是一种由RNA引导Cas9核酸酶对靶基因进行修饰的新技术[1,2]。CRISPR/Cas9技术包含两部分:一是sg RNA(Single guide RNA),通过碱基互补配对与DNA特异结合
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【参考文献】
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sgRNAcas9 (V3.0) User Manual
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sgRNAcas9 (V3.0) User Manual sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluatingpotential off-target cleavage sites. On target NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (N= A, T, C orG) OT NNNNNNX NNNNNNNNX NNNNNRG (R=A or G) OT NX NX NX NNNNX NNNNNNNNX NRG (R=A or G) POT X NNNXNNNNNNNNNNNNNNN NRG (R=A or G) POT NNX NNNNNNNNNNNNNNNNN NRG (R=A or G)
Notes: OT stands for off-targets, which contain all types of off- POT stands for potential off-target, onlycontain off-targets which are perfect match to the 12-nt seed region of the sgRNA, while outer segments contain mismatched bases. X stands for mismatched base. Install:1 Software environment
1.1 Manually download and install Java (also knownas Java Runtime Environment or JRE) for your computer ( ). 1.2 Manually download and install Perl for your computer ( ). 2 Graphical User Interface (GUI) and Prerequest for sgRNAcas9
Fig 1. Graphical User Interface of sgRNAcas9 “sgRNAcas9.log” is in the “logs”, please check this file for running information. Prepare sgRNAcas9 input (genes/genome) files, please note that sgRNAcas9 software do not allow any white space in the file name or file path!
Example of input sequences FASTA file (see “input”) >hEMX1_exon1 AGGTGAGCGGCGGCCAATGGGCGAGCGCGGGGCAGGTGCCCGCTAACTCGCGCCTCGCAGCGCTGGGCGGCCGGGGCTGGGCAGGGCAGTGCGGGGACACCGGGGGCTGGGGTCGGTCCCAGCGGGACTCCGAAAGGAGGGAGACGAGCTCAACCCTCGGGCCTTACTGGCAGCTCGCA >hEMX1_exon2 CCAGCGACGTGCCCCAGGACGGGCTGCTTCTGCACGGCCCCTTCGCACGCAAGCCCAAGCGGATCCGCACGGCCTTCTCGCCCTCGCAGCTGCTGCGGCTGGAGCGCGCCTTCGAGAAGAACCACTACGTGGTGGGCGCCGAGCGGAAGCAGCTGGCCGGCAGTCTCAGCCTCTCCGAGACGCAG >hEMX1_exon3 GTGAAGGTGTGGTTCCAGAACCGGAGGACAAAGTACAAACGGCAGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCTGAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGGCTCCCATCACATCAACCGGTGGCGCATTGCCACGAAGCAGGCCAATGGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAGGGTGGGCAACCACAAACCCACGAGGGCAGAGT Genome files canbe downloaded from ensembl ftp site(http://www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html) or NCBI website(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/) or other source. Downloaded human genomic sequences files:
Homo_sapiens.GRCh37.75.dna.chromosome1-22, X, Y Please combine multiple FASTA files into one big FASTA file. See “report”: Result of sgRNAcas9
There are 23 columns in the one of sgRNAcas9 output file “sgRNAcas9_report.xls”. Their meanings are:
field## meaning
sgRID## ID of the CRISRP target site Start## start sites End## End sites CRISPR_target_sequence## CRISRP target sequence(5'-3'), contain PAM "NGG" GC%## GC content OT## annotation of off-targets with No.of mismatches <=5 0M(on-/off-) ## on target site, if 0M >1, Repeat gene? or off-target sites with 0 mismatch 1M## off-target sites with 1mismatch 2M## off-target sites with 2mismatches 3M## off-target sites with 3 mismatches 4M## off-target sites with 4mismatches 5M## off-target sites with 5mismatches No.OT## total number of off-target sites POT## annotation of off-targets with perfect matchto the 12-nt seed region of the sgRNA (No.of mismatches <=5) 0M(on-/off-) ## perfect match to the 12-nt seed region of the sgRNA, outer segments with 0 mismatch 1M## perfect match to the12-nt seed region of the sgRNA, outer segments with 1 mismatch 2M## perfect match to the12-nt seed region of the sgRNA, outer segments with 2 mismatches 3M## perfect match to the12-nt seed region of the sgRNA, outer segments with 3 mismatches 4M## perfect match to the12-nt seed region of the sgRNA, outer segments with 4 mismatches 5M## perfect match to the12-nt seed region of the sgRNA, outer segments with 5 mismatches No.POT## total number of off-targets sites with perfectmatch to the 12-nt seed region of the sgRNA Risk_evaluation## evaluation of risk Risk of sgRNA:
Discard >High_risk > moderate_risk> low_risk > repeat_sites_or_bad ? > Best Please cites:
.sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluatingpotential off-target cleavage sites.
2014 Jun 23;9(6):e100448. Changzhi Zhao，Yi Zhang，Guanglei Li，Jiliang Chen，JingJin Li，Ruimin Ren，Pan Ni，Shuhong Zhao，Shengsong Xie. Development of agraphical user interface for sgRNAcas9 and its application.HEREDITAS(Beijing), ): .
Important Notes:
Note for business users: In July, 2015, the sgRNAcas9 (Graphical User Interface, GUI)software v2.0, which developed independently by the Huazhong Agricultural University, was certified by china state bureau of copyrights(No.897). All rights reserved.sgRNAcas9 is free for academic, nonprofit, and personal use.
If you have any questions, please do not hesitate to contact us.
Copyright & 2015, Huazhong Agricultural University.
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it is very useful,thank you all.
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