虎杖及其单体白藜芦醇治疗实验性自身免疫性重症肌无力的研究--《山东中医药大学》2014年硕士论文
虎杖及其单体白藜芦醇治疗实验性自身免疫性重症肌无力的研究
【摘要】：研究背景及目的
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种T细胞依赖、抗体介导的自身免疫性疾病，神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）处的乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor，AChR）为其主要自身抗原。实验性自身免疫性重症肌无力（experimentalautoimmune myasthenia gravis，EAMG）是研究MG发病机制和潜在治疗方法的可靠实用模型。
虎杖(polygonum cuspidatum，PC)微苦、微寒，具有清热、解毒、利湿、活血功效，白藜芦醇（resveratrol，Res）是其有效成分之一，它们除具有抗氧化、抗肿瘤、调节脂代谢等作用外，还具有抗炎、免调节作用。另外虎杖还可以治疗蛇毒咬伤，其正丁醇提取物（n-butanol extract of PC，PCB）在体外能上调人类神经母细胞瘤细胞系（human neuroblastoma cell line，SH-SY5Y）烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic ace-tylcholine receptor，nAChR）的表达。
关于中药对EAMG的研究较少且多以复方为主，单味苦寒类药物的研究更少，目前文献中尚未发现关于虎杖或其单体白藜芦醇对EAMG的研究。本实验目的是探讨虎杖及其单体白藜芦醇对EAMG是否有治疗作用及其可能的作用机制。
材料与方法
1.1实验动物：Lewis大鼠，雌性，140-160g，6-8周龄。
1.2抗原：鼠源AChR-α亚基97-116肽(R97-116)。
1.3药物：虎杖（中药颗粒），白藜芦醇。
2.1EAMG模型的诱导和临床评分
用R97-116免疫Lewis雌性大鼠建立EAMG模型，每天记录大鼠体重，并参照Lennon EAMG评分标准每天给予大鼠临床评分。
2.2虎杖及白藜芦醇治疗EAMG
随机将大鼠分为虎杖组（PC组）、白藜芦醇组（Res组）、对照组（C组），每组5只，于首次免疫后第5天开始每天分别给予PC（2g/kg）、Re（s20mg/kg）（溶于DMSO水溶液）相应治疗组大鼠灌胃，对照组给予等浓度DMSO（0.4ml/kg）溶液，直至EAMG大鼠发病高峰期第42天。
2.3CCK-8检测淋巴细胞增殖
取腹股沟淋巴结制备淋巴结单个核细胞（lymph node mononuclear cells，LMNC）悬液，进行CCK-8细胞增殖实验。
2.4Elisa检测大鼠血清及淋巴细胞培养细胞上清细胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-4,IL-10, IL-17）
2.5Elisa检测大鼠血清抗R97-116抗体（IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b）
2.6免疫荧光检测大鼠腓肠肌NMJ突触后膜AChR
2.7统计方法：本实验数据采用SPSS16.0统计软件分析，对3组样本进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较用LSD-t检验，对不满足方差齐性者采用Kruskal-Walli（sK-W）检验，P0.05有统计学意义，结果以均数±标准差（Means±SD）表示。
1.虎杖及白藜芦醇能缓解EAMG大鼠肌无力症状
2.虎杖及白藜芦醇对EAMG大鼠CCK-8淋巴细胞增殖的影响
在PBS、R97-116刺激条件下PC能抑制淋巴细胞增殖，Res对淋巴细胞增殖虽无统计学差异但有一定抑制趋势。
3.虎杖及白藜芦醇对EAMG大鼠血清和淋巴细胞培养上清中细胞因子的影响
虎杖及白藜芦醇下调血清及细胞培养上清中TNF-α，而对IL-10表现为上调，对IFN-γ、IL-4、IL-17无明显影响。
4.虎杖及白藜芦醇对EAMG大鼠血清抗R97-116抗体的影响
虎杖及白藜芦醇能降低血清中IgG1、IgG2a抗体水平，对IgG、IgG2b无明显影响。
5.肌肉免疫荧光：治疗组AChR密集、结构相对完整，而对照组AChR结构不完整、局部缺如、相对凌乱，说明虎杖及白藜芦醇可能通过增加AChR表达和(或)减少其被破坏而保护EAMG大鼠NMJ-AChR。
1.虎杖及其单体白藜芦醇能缓解EAMG症状，可能通过以下三方面机制发挥治疗作用：①通过抑制淋巴细胞增殖，下调TNF-α，上调IL-10，进而抑制EAMG大鼠血清R97-116抗体（IgG1, IgG2a）的产生；②虎杖及白藜芦醇代谢产物可能对R97-116抗体（IgG1, IgG2a）分子具有清除作用；③虎杖及白藜芦醇代谢产物可能增加神经肌肉接头AChR表达。
2.单体白藜芦醇可能是虎杖缓解EAMG的主要有效成分，需进一步实验明确。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东中医药大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R277.7【目录】：
提要3-6Abstract6-11引言11-12第一部分 材料与方法12-19 1. 材料12-14
1.1 动物12
1.2 试剂12-13
1.3 仪器13-14
1.4 耗材14 2 方法14-19
2.1 动物饲养、EAMG 模型诱导和临床评分14
2.2 虎杖及白藜芦醇治疗 EAMG14-15
2.3 CCK-8 检测淋巴细胞增殖15
2.4 Elisa 检测大鼠血清及淋巴细胞培养上清细胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17）15-16
2.5 Elisa 检测大鼠血清抗 R97-116 抗体（IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b）16-17
2.6 免疫荧光检测大鼠神经肌肉接头突触后膜 AChR17-18
2.7 统计学处理18-19第二部分 结果19-30 1. 虎杖及白藜芦醇能缓解 EAMG LEWIS 大鼠肌无力症状19-21 2. 虎杖及白藜芦醇对 EAMG LEWIS 大鼠 CCK-8 淋巴细胞增殖的影响21-22 3. 虎杖及白藜芦醇对 EAMG LEWIS 大鼠细胞因子的影响22-26
3.1 虎杖及白藜芦醇能降低大鼠血清及细胞上清中 TNF-α水平22-23
3.2 虎杖及白藜芦醇对大鼠血清及细胞上清中 IFN-γ的影响23-24
3.3 虎杖及白藜芦醇对大鼠血清及细胞上清中 IL-4 的影响24-25
3.4 虎杖及白藜芦醇能升高大鼠血清及细胞上清中 IL-10 水平25
3.5 虎杖及白藜芦醇对大鼠血清及细胞上清中 IL-17 的影响25-26 4. 虎杖及白藜芦醇对 EAMG LEWIS 大鼠血清抗 R97-116 抗体26-28
4.1 虎杖及白藜芦醇对大鼠血清抗 R97-116 抗体 IgG 的影响26-27
4.2 虎杖及白藜芦醇能降低大鼠血清抗 R97-116 抗体 IgG1、IgG2a 水平27-28
4.3 虎杖及白藜芦醇对大鼠血清抗 R97-116 抗体 IgG2b 的影响28 5. 虎杖及白藜芦醇能保护 EAMG LEWIS 大鼠 NMJ-ACHR28-30第三部分 讨论30-36 1. MG 发病机制30-31 2. EAMG 模型制备31-32 3.中医学对 MG 的认识32-33 4. PC 及其单体 RES 能缓解 EAMG 病情33-36
4.1 PC 的药性33
4.2 PC 和 Res 抗炎、免疫调节及 AChR 保护作用33-36第四部分 结论36-37参考文献37-43符号说明43-44致谢44-45发表论文及参与课题45-46详细摘要46-50
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