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转：RNA原位杂交技术总结
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RNA原位杂交技术( In situ hybridization, ISH)是、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术。1969 年美国耶鲁大学的Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,将该基因进行定位,与此同时Buongiorno -Nardelli和Amaldi等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,从而创造了原位杂交技术。
& && & 研究基因的表达模式是探索基因功能的重要环节之一。利用Northern 杂交可以说明特定基因在不同组织器官、不同时期的表达情况，但是若要在显微或亚显微水平对基因的时空表达模式进行研究。单靠Northern 杂交就显然不够了，而根据核酸分子杂交的基本原理和免疫组织化学的方法而发展起来的RNA原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)为此提供了行之有效的解决途径。
& && & RNA原位杂交经常被用于检测动物或植物组织中某种特定基因的mRNA的分布状况，以了解该基因的表达模式。RNA原位杂交主要是利用碱基互补原理，将体外合成的带有标记的单链反义mRNA与组织或细胞中特定基因的mRNA发生杂交，从而将反义探针定位在特定基因的表达区域内。
& && & 探针上所带的标记可分为2种，即非放射性的地高辛(DIG)和生物素(BIO)或带有放射性的同位素(32P)。带有放射性同位素的探针在杂交后可以直接通过放射白显影来确定该特定基因的表达区域；带有非放射性标记的探针还需通过酶促免疫显色或免疫荧光反应来定位特定基因的mRNA在组织或细胞中的分布位置。
& && &&&以非放射性的DIG为标记的RNA原位杂交为例：当体外转录的反义mRNA探针与组织中的天然mRNA杂交后，带有碱性磷酸酶(AP)的抗DIG抗体特异性地结合探针上的DIG标记，从而将带AP的抗DIG抗体定位于特定基因的mRNA分布区域内：而后加入AP的无色底物，底物在AP的作用下变为有色沉淀沉积在相应区域，从而将看不见的信号转变为肉眼可见的。
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随着分子生物学技术的迅速发展,在最初的原位杂交技术的基础上发展起来许多新的技术,包括荧光原位杂交( fluorescence in situ hybrdization ,FISH) ,基因组原位杂交(Genomic in situ bybridization, GISH) ,染色体显带技术与原位杂交技术相结合创建了原位杂交显带技术, PCR与原位杂交技术结合创建了原位PCR技术( In situ PCR)。
荧光原位杂交( fluorescence in situ hybrdization, FISH )
& & Pinkel等( 1986 )首次报道了荧光原位杂交,即用荧光素标记探针以检测杂交信号的技术。其原理是利用特异的DNA探针,标以生物素、地高辛或荧光素,对细胞的染色体铺片或切片进行DNA- DNA原位杂交,其杂交定位信号用荧光显示。与其它的ISH方法相比,它周期短、灵敏度高,还可以用不同颜色的荧光素标记DNA探针对同一张切片进行原位杂交,同时观测不同的DNA探针在染色体上的杂交位置。应用FISH技术可以准确快速地构建物理图谱,得到探针之间的顺序、方向和真实的物理距离,是基因定位的重要手段。
基因组原位杂交( Genomic in situ bybridizaion, GISH)
& & Landegent等(1987)创建了染色体原位抑制杂交(Chromosome in situ
suppression, CISS) 。这一方法的技术关键是用重复DNA封闭重复序列,可避免非特异性杂交信号的干扰。提高杂交特异性和准确性。由抑制杂交进一步衍生出来的基因组原位杂交(GISH) ,可以在细胞分裂的各个时期来检测不同染色体组的染色体,并且可以检测出不涉及带型明显变化的染色体断裂点及其外源染色体片段的大小。该技术利用某个多倍体或某个杂种的一个亲本标记的总DNA作探针,而另一亲本的基因组DNA作封阻与该多倍体或杂种的染色体进行杂交,在杂交过程中标记的DNA优先与完全同源的DNA序列杂交,根据杂交结果来推测异源多倍体的染色体组成或异源染色体片段的渗入状况。因此,它可用于分析植物基因组结构,确定外源DNA的插入位置及定量分析,鉴定外源染色体片断,分析植物杂交品种染色体成分来源以及进行近种属或品系的比较研究。
原位杂交显带技术( in situ hybrdization banding, ISHB)
& & Neslson等( 1989 )创建了原位杂交显带技术。他利用染色体上短的、散在重复序列( SINES)的一AluDNA基因家族作为探针与染色体标本杂交,结果得到了类似于R带的带型 。这样进行基因定位时,只需将目的基因探针与染色体上SINES探针同时应用,用不同颜色的荧光标记,便可以同时显示出杂交信号和杂交体带型,排除了杂交与显带之间的相互影响。J iang等(1993) 将染色体显带技术与原位杂交技术相结合,首次将重复的DNA序列定位在黑麦染色体进行原位杂交,取得了满意的结果。在一个片子上显带后再进行原位杂交,既能确定特定的染色体,又能确定探针所杂交的具体位点,应用这种方法把多拷贝的DNA序列和外源DNA片段插入点定位在经过显带的小麦染色体上。
原位PCR ( in situ polymerase chain reaction, ISPCR)
& & Haase等(1990) 首次报道了原位DNA多聚酶链反应,简称原位PCR ( in situ PCR) 该技术结合了传统的高效扩增和原位杂交的细胞定位的优点,能够在组织切片，细胞等样品检测到低拷贝甚至是单拷贝的DNA和RNA,并在细胞形态学上准确定位。通过揭示细胞低拷贝核酸的分布,可进一步进行病毒感染、基因突变、染色体易位、基因低水平表达等研究。原位PCR技术主要有一下几类。直接原位PCR ( direct in situ PCR) 使用标记的引物或游离核苷酸进行原位PCR反应,这种标记分子随后进入扩增产物中,扩增结果可直接观察而不需要进行原位杂交。直接原位PCR具有操作简便、流程短、省时的优点。其缺点是特异性差,易发生引物错配或非特异性退火,易出现假阳性,标记的引物会降低PCR效率,不太适于切片标本。
间接原位PCR ( indirect in situ PCR) 　
& & 在没有标记物的情况下进行PCR 反应,扩增反应结束后,再用原位杂交技术来检测扩增的信号。此方法可以克服直接原位PCR的缺点,但需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程,因此实验的流程长,操作繁琐、费时。
原位反转录PCR ( in situ reverse transcription PCR) 　
& & 在原位PCR中加上一步反转录(RT)过程,以新形成的cDNA作为模板用于扩增,这个过程称为原位反转录PCR (原位RT2PCR) 。该方法结合了反转录反应和PCR扩增检测细胞或组织内低拷贝(10～20拷贝) mRNA或特异基因的表达。在原位RT2PCR中,首先要对组织样品进行DNA 酶处理,以破坏组织细胞中的DNA。1991年, cetus公司推出了一种酶,可以同时执行RT和PCR反应,从而减少了反应时间。
& & RNA原位杂交技术虽是一项较为成熟的技术，但仍在发展之中。这一技术不仅可能成为Northern blot的重要补充工具，而且在临床诊断中有着广阔的应用前景。
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随着功能基因组时代的到来，有必要了解这些新基因的功能及在发育过程中的表达模式．而整体原位杂交技术正好为了解胚胎发育过程中的基因表达供了帮助与传统的切片原位杂交技术相比，整体原位杂交有以下优点：1)能够直观地观察基因在整体中的时空表达分布，能很精确的反映基因表达的三维信息 2)可以同时分析几个组织块、胚胎或不同发育阶段的胚胎．
& & 整体原位杂交技术一方面为大规模的筛选区域及组织特异性候选克隆提供了有利的技术手段．随着鼠胚胎早期发育阶段cDNA文库的完善，该技术可大规模的分离胚胎发育中重要的调节子，从而为胚胎形成模式提供了一个重要的新的分子遗传标志库 ．另一方面为检测某些细胞群在体内的原位转录本， 并阐明分化过程中的分子遗传事件提供了帮助．如， 鼠胚胎干细胞(ES细胞)为多能干细胞，其分化有助于了解胚胎的正常发育过程，而整体原位杂交技术能检测到其中某些少量的亚类细胞群在基因表达中的重要变化，而这些轻微的异质性是不能用总RNA的方法所能检测到的 ．此外，两个或多个基因在同一细胞内的共表达或两个基因在相邻细胞中的有序表达， 为了解分子信号传导通路提供了一个可靠的切入点．
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小鼠胚胎整体原位杂交的基本操作步骤如下:
胚胎从小鼠体内取出来之后：
在新鲜的用PBS配置的4%的多聚甲醛（PH=7.4）中于4° C固定过夜。
将胚胎放在PBT中洗5分钟，室温慢慢摇晃
在用PBT配置而成的25%, 50%, 75%，100%的甲醇溶液梯度中脱水，
每次5分钟，室温慢慢摇晃（胚胎大一点可适当延长时间）
100%的甲醇-20度保存。（最多保存6个月）
杂交第一天：
在75%, 50%, 25%用PBT配置的甲醇中复水，每次5分钟。（胚胎大一点
可适当延长时间）
在室温PBT中洗2次，每次5分钟。
3& && && && && &
在室温下用PBT临时配置而成的6%的过氧化氢室温漂洗胚胎1-2小时并慢慢摇晃
在PBT中洗3次，每次5分钟
用PBT配置而成的10 mg/ml的蛋白酶K37度处理胚胎5-30分钟，随胚胎发育的时间而定。
6.5 dpc: 4 min
7.5 dpc: 4-5 min
8.5 dpc: 6 min
9.5 dpc: 10 min
10.5 dpc: 15 min
11.5 dpc: 20min
12.5 dpc: 25min-30min
在用PBT新鲜配置的2 mg/ml的甘氨酸溶液中洗10分钟
在PBT中洗两次，每次5分钟
在室温下用PBT配置的4%多聚甲醛和0.2%的戊二醛重新固定20分钟。
在PBT中洗两次，每次5分钟
10 在1：1的杂交液：PBT洗10分钟。
11 在杂交液中洗10分钟
12 在70度杂交液中温育至少一小时（通常3到4个小时）
13 在加了RNA探针的杂交液在70度温育过夜，至少16小时以上。
杂交第二天：
首先在70度预热溶液I，然后在70度洗胚胎3次，每次30分钟。（溶液I
可预先放于37度）(注：此时可配封闭剂，和TBST（用灭菌水配制）
封闭剂的配置：用TBST中加入羊血清（终浓度为10%）,和ROCHE的封闭剂（终
浓度为0.1%）同时可以进行小鼠胚胎粉预吸附抗体的实验步骤：
3mg的小鼠胚胎粉溶于500ul的TBST溶液中，用枪稍微混匀
70度30分钟
混匀10分钟
冰上加入50ul灭活羊血清和1ul的地高辛抗体
4度慢慢摇晃1小时，可适当延长
4度12000转离心10分钟
用封闭剂按要求稀释上清，（一般是稀释2000倍，即向上清液中补加1.5
毫升的封闭剂），并加入0.1%的tritonX-100
在溶液II中室温洗三次，每次5分钟
在溶液II中（含100ug/mlRNA酶A），37度洗两次，每次30分钟。
在65度预热溶液III，然后在该温度下洗胚胎3次，每次30分钟。
在室温下用新鲜的TBST洗胚胎3次，每次5分钟
室温下封闭胚胎60-90分钟，实际操作时延长封闭时间更好
加入地高辛抗体4度慢慢摇晃过夜至少16小时。
杂交第三天：
1 用新鲜灭菌水TBST室温洗三次每次5分钟
2 1-1.5小时之内TBST室温洗五次，
3 TBST 4度过夜，慢慢摇晃。
杂交第四天：显色
1 室温用新鲜灭菌水配置的NTMT洗三次每次至少10分钟。
2 在灭了菌干净的培养皿中加入8毫升的NTMT，并各加入BCIP 和NBT20ul
如果胚胎多要多用几个皿。
慢慢摇晃并避光
4 30分钟-几个小时之内完成显色
5 用PBS洗胚胎10分钟或更久，终止反应
6用PBT配置的4%多聚甲醛和0.2%的戊二醛重新固定20分钟
7用PBS洗胚胎两到三次
8 50%的甘油30分钟
9 80%的甘油-20度保存。摄影记录。
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10X PBS (1 liter):
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
(adjust to pH 7.4 with HCl and bring to 1 liter with water)
1X PBS plus 0.1% or 1%* Tween
*NOTE: For mouse embryos, it is recommended that all solutions with
Tween contain 1%, rather than 0.1%.
Tween is routinely used at 0.1% in the chick protocol.
Hybridization solution: 存于-20度
50% formamide 甲酰胺
5X SSC, pH 4.5 (use citric acid to pH)
50 mg/ml yeast tRNA （买回来是5毫克每毫升共500微升）
50 mg/ml heparin
配10毫升：
需要：甲酰胺 5毫微升
20X SSC, pH 4.5 2.5毫升
yeast tRNA
heparin 0.0005克
还需要加水1.4毫升的水
Solution I: 存于-20度
50% formamide
5X SSC, pH 4.5
配10毫升：
5毫升 formamide
2.5毫升20 X SSC
1毫升10% SDS
还需要加水1.5毫升
SolutionII:（要用灭过了菌的水配制）
10mM Tris7.5
0.1% tween20
配10毫升：
5毫升1M的NaCl
100ul1M的Tris-HCL(PH=7.5)
0.1% tween-20 (即10ul)
还需要加水4.9毫升
Solution III: 存于-20度
50% formamide
2X SSC, pH 4.5
0.1% Tween (NOTE: this is only included for young chick embryos,
5毫升formamide
1毫升 20 X SSC
0.1% tween-20 (即10ul)
还需要加水4毫升
Sheep serum:
inactivate by heating to 70°C for 30 minutes, store in aliquots at -20°C.
10X TBS (for 1 liter):
250 ml 1M Tris-HCl, pH 7.5
(bring to 1 liter with water)
TBST: 要用灭过了菌的水配制
1X TBS plus 0.1/1% Tween
2 mM (0.5 mg/ml) Levamisole 左旋咪唑
(NOTE: most people no longer add levamisole to TBST)
NTMT: 要用灭过了菌的水配制
100 mM NaCl
100 mM Tris-HCl, pH 9.5
50 mM MgCl2
0.1/1% Tween-20
2 mM (0.5 mg/ml) Levamisole 左旋咪唑
200X NBT: 临用前配制
50 mg/ml NBT in 70% DMF
200X BCIP: 临用前配制
25 mg/ml BCIP in water
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在实验过程中我们需要注意以下几个方面：
蛋白酶K 的处理时间
这一步是杂交成功与否的关键因素， 蛋白酶K处理的目的是为了提高胚胎组织
对探针的通透性．以便探针能够有效地进入组织细胞内与mRNA靶分子进行杂
交．如果处理不足，则会导致探针不能有效地渗透至组织内，不能显示杂交信
号．整体原位杂交时，蛋白酶K处理的时间一般需要7～10 min．其处理时间可
根据胚胎的大小不同而定：E8～9：8 min、E10:10 min；在本实验中，我们主要
通过眼睛检测蛋白酶K消化是否适度，当看见卵黄囊的碎片从胚胎体有脱落时，
即可终止反应．延长蛋白酶K消化时间是为了更有利于探针的渗透，但是过之，
则会导致低信号的发生．组织中的mRNA会因此弥散，被漂洗掉．可见．蛋白酶
K消化处理是非常重要的一个步骤．
探针及抗体浓度
探针和抗体浓度的高低对于杂交信号的强弱以及背景的高低都有很大的影响．探
针及抗体浓度大，则可以得到较强的杂交信号，但背景色有可能较深，影响信号
的观察．反之，在实验中，可通过降低探针和抗体浓度来减少高背景．降低探针
浓度可减少非特异性的杂交， 而降低抗体浓度可避免非特异的显色，避免高背
景的现象．综合我们研究的经验，我们认为，在对交配后7～9 d的小鼠胚胎进
行整体原位杂交时，使用l～2 mg／L的探针浓度和1：2 000的抗体浓度是比较
无论是探针杂交后的漂洗还是抗体孵育后的漂洗，都可以有效的降低显色背
景．因此，在探针杂交后和抗体孵育后都需要充分的漂洗．另外，可通过延长1
h溶液1的漂洗以降低背景，同时在抗体漂洗后，将胚胎置于MABT 4℃过夜，然
后在显色前漂洗1 h，2次，此步尤其适合E10的胚胎．另外，杂交后使用RNase
A充分降解未杂交的RNA探针也是降低背景信号的有效方法之一．。
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duo xie le
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如果是已做好的组织蜡片，想做基因的原位杂交对基因的表达进行细胞定位，有啥主意的地方吗，组织蜡片的效果会怎么样，请高手指点一下
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杂交后用RNase处理：未杂交上的RNA也会造成背景信号吗？
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秀基因 个 秀蛋白 个上海闪晶-Taqman探针-MGB探针-分子信标-原位杂交探针(FISH探针)-RNA合成-硫代修饰
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闪晶生物siRNA载体构建服务程序：
1. siRNA表达载体的选用：
本公司选用的siRNA 表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记，可以建立稳定表达系，同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp抗性基因，可以无限扩增。
2. 设计siRNA靶序列
A 、根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19 － 21nt 长。
B 、对于每条选定的siRNA 靶序列，设计 siRNA 正义链和反义链，以 loop(9nt) 相连，称为 shRNA（short hairpin RNA）。
C、阴性对照的设立
3. 合成模板：
合成每条编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，退火 DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamHI 和 HindIII 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamHI 和 HindIII 酶切位点之间。
4. siRNA 空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1 ％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。
5. 连接与转化：
把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为 3 ： 1 。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37 ℃培养过夜。
6. PCR 鉴定
7. 测序鉴定
8.柱抽提阳性克隆载体并定量。
1-3个siRNA表达载体构建
1800.00/个
14个工作日
4－10个siRNA表达载体构建
1500.00/个
20个工作日
版权所有 &2004
上海闪晶分子生物科技有限公司(上海闪晶分子生物技术研究所)
地址：上海市闵行区北桥镇吴河路328号A栋2楼 邮编：201109 电话/传真：021- Email:shinegene@BioonGroup旗下网站
原位杂交技术和操作步骤详细介绍
原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
多种探针标记检测系统
基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。
荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。
通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。
原位杂交中探针的选择
DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。
就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。
Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：
原位杂交检测步骤
原位杂交涉及的步骤 ：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1.玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片， 1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2.样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液 (pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 C30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5& min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3.探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4.原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖（见下）。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性 ，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃ 10min。
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+& 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours
杂交后的洗涤
杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。常规洗涤条件为含50%甲酰胺的 2×SSC。但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。
5.免疫细胞化学反应 (报告分子标记的探针)
如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。如进行生物素标记的探针杂交和检测，在含Tween 20 和BSA的 PBS中进行封闭。
&如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含Blocking Reagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 M NaCl将有助于防止背景染色。封闭后再 进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C& 30 min孵育 (或室温2h孵育)。抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5C10 min的洗涤。
酶反应显色：使用POD和底物DAB/咪唑构成的显色系统、AP和底物BCIP/NBT构成的显色系统；酶免反应的检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好。另外，AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/Fast Red TR, 用于提高荧光检测的灵敏度。
6.显微镜检测
POD和AP的底物显色反应后使用普通的显微镜镜检，且显色可永久保留。该检测手段能满足大部分研究的灵敏度需求。对于样品厚度较高或密度较大的情况，可使用相差显微镜进行镜检。
如使用荧光标记的探针，则在杂交和洗涤步骤后直接用荧光显微镜观察。荧光探针配合荧光显微镜的检测是进行多重探针检测的良好手段，检测时建议使用抗荧光衰减封片剂，以减缓荧光淬灭。DNA复染用的PI或DAPI可直接溶于封片液进行染色(40 ng DAPI/ 100 ng PI/ml) 。
原位杂交实验文献参考：
该文献对组织切片和FFPE样品的原位杂交检测步骤进行了详尽的探索和优化，简化了实验的操作步骤，并能在复杂样品的杂交实验中原位检测到低拷贝的靶mRNA表达（20~30拷贝/细胞） 。（link to 文章2）
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