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【求助】紧急请教糖蛋白糖基化修饰
【求助】紧急请教糖蛋白糖基化修饰
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这个帖子发布于7年零82天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我需要表达的目的蛋白本来就是糖蛋白，根据糖基化位点要求，我通过碱基突变该变了其两个氨基酸从而另外增加了一个糖基化位点：N-X-T我突变的糖基化位点离该二硫键形成部位较近，有十几个氨基酸。通过CHO细胞表达纯化后与天然的该蛋白一起8％SDS-PAGE还原与非还原电泳鉴定，发现二者的位置相同，有点弥散（可能因为是糖蛋白的缘故）。根据之前预想：如果加上了糖链那么分子量就会增大，则与天然的该蛋白一起电泳就可以鉴别。现在它们在胶上的处于同一位置，这是否说明没有加上糖链？还是因为即使加上糖链后对分子量的影响不足以达到通过电泳看出来？有没有其它更灵敏方法检测？
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通过软件分析我所突变位点的糖基化机率很高，甚至比该蛋白本身的一个糖基化位点的糖基化机率还高，当然这仅是软件预测而已，经过这几天讨论认为SDS-PAGE胶上不能反应出较小分子量的差别.
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怎么没人指点一下啊？请做过相关方面实验的高手提供些建议吧！确实很急啊！不然毕业都成问题了
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非常感谢spring_come的指点，今天我打了许多机构（提供MS检测服务）的电话，含糖量在20％下结果才可靠。现在准备用CE，看能否有所进展。另外我能否问你个问题：形成糖链的九种单糖的分子量大概分别是多少？我一直没看见有关方面的文章
createmyworld edited on
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我所突变的糖基化位点位于分子表面,我在下周去做质谱检测
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关于丁香园原核生物糖基化修饰系统及其应用前景--《生物技术通讯》2012年02期
原核生物糖基化修饰系统及其应用前景
【摘要】：传统认为只有真核生物才有蛋白质糖基化修饰现象,虽然在原核生物细胞中发现糖蛋白的存在已经有数十年,但是没有引起我们足够的重视。最近,在细菌中发现了蛋白质的糖基化修饰系统,最具代表性的是空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统、脑膜炎奈瑟球菌和绿脓杆菌的O-糖基化修饰系统。这些糖基化修饰系统已成功地转移到大肠杆菌中,并且独立发挥其糖基化修饰作用。寡糖转移酶在修饰过程中起关键作用,且寡糖转移酶对糖底物的特异性要求非常低,这使得按照我们的需求来"定制糖蛋白"成为可能,并标志着"原核生物糖基工程"的到来,这将为糖结合疫苗的发展提供良好的契机。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：Q51【正文快照】：
真核生物细胞内蛋白质糖基化修饰的研究由来已久,早在20世纪30年代末科学家就证实真核生物细胞内存在蛋白糖基化修饰系统。但是,长期以来我们都认为原核生物细胞内不存在蛋白质糖基化修饰系统,尽管早在20世纪70年代就在革兰阴性细菌盐生盐杆菌(Halobacterium salinarium)中发
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京公网安备74号蛋白质糖基化位点鉴定 - 分子生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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蛋白质糖基化位点鉴定
在毕赤酵母中新表达一个重组蛋白，已确定其发生了糖基化现象，现想对其进行糖基化位点的鉴定，主要想通过胶内酶解——肽段富集——质谱分析——数据库检索等系列流程，问一下小木虫的各位大侠，有没有做过相关的工作，在国内一般哪个公司或研究机构做的比较好收费便宜？
谢谢各位！:tiger06:
质谱鉴定可以比较容易地检测糖基化。你可以找北京大学中心实验楼质谱室，在北京大学医学部2楼，那里设备是MADI-MS,精度还可以收费可能是北京地区最低的，及对北京大学内部服务也对北京大学之外服务。北京大学生物医药检测中心质谱室的收费比北京生命科学研究所旳质谱收费至少40%，如果你能找到北京大学医学部的实验室请他们出北京医学部内部收费条去北京大学中心实验楼质谱室做质谱，你给该实验室现金，那么价格还可再便宜一半。北京大学中心实验楼质谱室联系电话：010-. 更正：“那里设备是MALDI-MS”，我是提笔忘字，;)。 具体请参见：Methods in Molecular biologu Vol-446 Post- Translational Modifications of Proteins, 2009,2nd Editon,不知为什么，不让我上传此书。
或者参考：Current protocols in protein sciences，wily，2002，该书免费下载（分为各章）：
.cn/u//ish?folderid=515844&page=0 : Originally posted by 凌波丽 at
质谱鉴定可以比较容易地检测糖基化。你可以找北京大学中心实验楼质谱室，在北京大学医学部2楼，那里设备是MADI-MS,精度还可以收费可能是北京地区最低的，及对北京大学内部服务也对北京大学之外服务。北京大学生物医 ... 感谢回复！可是要分析糖基化位点，貌似是要做肽段谱图，需十分精确，我查询到的公司一般用的都是nano-LC-MS/MS，为纳升级别的，且还需去糖基化酶进行去糖基化。请问你知道具体情况，能做这个吗？ MALDI-MS可以完成多肽的糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化等各种共价的修饰。具体样品准备你可以和有关实验室和检测中心协商。肽段谱图一般用胰蛋白酶有限水解蛋白质即可，因为肽分子量过大质谱无法精确检测出分子量，到用软件找匹配时结果不唯一。不过糖基的分支点肯定无法直接由MALDI-MS可以测出，必须在样品准备时使用不同的糖基酶有限水解后用MALDI-MS测定后拼装。 : Originally posted by 麦堂straw at
感谢回复！可是要分析糖基化位点，貌似是要做肽段谱图，需十分精确，我查询到的公司一般用的都是nano-LC-MS/MS，为纳升级别的，且还需去糖基化酶进行去糖基化。请问你知道具体情况，能做这个吗？... “要分析糖基化位点，貌似是要做肽段谱图，需十分精确。"不是貌似肽段谱图，而是貌似Ladder Sequencing，即Ediman降解结合质谱测定多肽序列，也就是用质谱代替凝胶电泳测定每一步Ediman降解之后减少一个氨基酸残基分子量的多肽段的相对分子量，但是现在能够用串联质谱直接测定多肽段的氨基酸序列了，不用在结合用Ediman降解。而且许多的多肽的糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化等各种共价的修饰，尤其是磷酸化修饰已经能够直接从质谱读出。但是不幸的是糖分子不是线性分子，而是可能有很多分支。至少在分支位点必须用糖苷酶水解以确定分支的类型，目前的质谱还打不到能够区别糖链不同分支的水平。 MMB 446 Post-Translational Modifications of Proteins, 2009,2nd Ed,
楼主参考一下了，有具体问题我们还可以自讨论. 今天就到这里，御姐我今天下午还要去拜访几位重要的客人；楼主愿意与我继续讨论，可以贴出来，不愿意就算了。GOOD LUCK！ : Originally posted by 凌波丽 at
今天就到这里，御姐我今天下午还要去拜访几位重要的客人；楼主愿意与我继续讨论，可以贴出来，不愿意就算了。GOOD LUCK！ 十分不好意思，刚一直做实验，没有及时回复。谢谢你提供的参考信息，我会认真阅读，我之前一直在做克隆，对蛋白修饰质谱分析方面完全是小白，不懂的地方还请多多指教，谢谢！:work: : Originally posted by 麦堂straw at
十分不好意思，刚一直做实验，没有及时回复。谢谢你提供的参考信息，我会认真阅读，我之前一直在做克隆，对蛋白修饰质谱分析方面完全是小白，不懂的地方还请多多指教，谢谢！:work:... 大家共同学习。:D Experimental Glycoscience ----Glycochemistry(2008)(免费下载）
http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=5794860
该书包括质谱检测糖基，楼主免费下载后自己看吧。 : Originally posted by 麦堂straw at
十分不好意思，刚一直做实验，没有及时回复。谢谢你提供的参考信息，我会认真阅读，我之前一直在做克隆，对蛋白修饰质谱分析方面完全是小白，不懂的地方还请多多指教，谢谢！:work:... 想鉴定糖修饰类型和糖修饰位点的话，MALDI-TOF是不能完成的，MALDI-TOF只能检测酶解肽段的m/z信息，不能给出更多的数据，必须用LC-MS/MS二级质谱来做。但是这里有个问题，就是糖基化修饰的共价键比较容易打断，国内很多的二级质谱用的是CID或者HCD，高能氦气进行碎化处理，很容易丢失糖基化修饰，所以，牵涉到糖基化修饰定位，但凡能鉴定出来多少就是多少了，不求完全鉴定。北京那边的质谱我做过检测分子量的（maldi-tof），没做出来，不知道是不是我运气不好。国内糖基化修饰钱小红做的比较好（其他人不知道），她鉴定了一系列的肝病相关糖基化修饰。楼主要做的和隔壁实验室一个同学做的非常类似，要鉴定酵母表达蛋白的糖基化修饰，去了一个北京的质谱实验室摸了一下条件，最后不了了之。祝你好运！！！ : Originally posted by 山水老流氓 at
想鉴定糖修饰类型和糖修饰位点的话，MALDI-TOF是不能完成的，MALDI-TOF只能检测酶解肽段的m/z信息，不能给出更多的数据，必须用LC-MS/MS二级质谱来做。但是这里有个问题，就是糖基化修饰的共价键比较容易打断，国内 ... 感谢回复~很多人提到钱小红做糖基化修饰很牛，我再去联系联系看:tuzi10:
另，蛋白分子量检测质谱（MALDI-TOF-MS）应该挺普通的吧，我们实验室都是送样到北京中科院过程所，效果还可以，300块一个样，你要的话可以给你联系方式或者你也可以自己进他们网站查询。 : Originally posted by 麦堂straw at
感谢回复~很多人提到钱小红做糖基化修饰很牛，我再去联系联系看:tuzi10:
另，蛋白分子量检测质谱（MALDI-TOF-MS）应该挺普通的吧，我们实验室都是送样到北京中科院过程所，效果还可以，300块一个样，你要的话可以 ... 呵呵，钱小红和贺福初是一个团队的，据说他们团队的质谱仪器得论排来数，有钱就是好啊。
ps，感谢你的建议，不过蛋白质分子量测定我已经搞定了，在华大完成的，检测结果和理论值竟然一致，我都不敢相信，这是题外话了，呵呵。
话说想问一下，你知道哪里有利用NMR测定小分子结构的实验室吗，比如寡糖/糖肽，谢谢！ : Originally posted by 山水老流氓 at
呵呵，钱小红和贺福初是一个团队的，据说他们团队的质谱仪器得论排来数，有钱就是好啊。
ps，感谢你的建议，不过蛋白质分子量测定我已经搞定了，在华大完成的，检测结果和理论值竟然一致，我都不敢相信，这是题外 ... 这个真不清楚，我也是刚做糖基化分析，我们实验室做这方面的就我一个，所以现在也是摸石头过河，没什么经验可以借鉴,话说NMR我都是百度一下才知道代表个什么东西，你发个帖子或者到网上再去找找看吧，抱歉帮不了你。你们实验室在哪哦，也都是送样到北京吗，好奇一下你们隔壁实验室的童鞋最后糖基化位点是鉴定到了还是木有结果。。。 : Originally posted by 麦堂straw at
这个真不清楚，我也是刚做糖基化分析，我们实验室做这方面的就我一个，所以现在也是摸石头过河，没什么经验可以借鉴,话说NMR我都是百度一下才知道代表个什么东西，你发个帖子或者到网上再去找找看吧，抱歉帮不了你 ... 我这边是武大生科院的，我们实验室蛋白质谱鉴定都是送到华大北京那边检测的。隔壁实验室的童鞋在北京杨福全老师（记得不是很清楚）那里做了几次预实验，没什么结果，蛋白就用完了。所以，你最好多查相关的文献，做好充分准备。不是说成功总是亲睐有准备的人嘛！:tuzi24: : Originally posted by 山水老流氓 at
我这边是武大生科院的，我们实验室蛋白质谱鉴定都是送到华大北京那边检测的。隔壁实验室的童鞋在北京杨福全老师（记得不是很清楚）那里做了几次预实验，没什么结果，蛋白就用完了。所以，你最好多查相关的文献，做 ... 嗯，是这样说的，最近网上不流传一篇文章，叫《水喝多了，尿自然就有了》，大意就是看的多了，做的多了，论文也就有了，好期待那一天:tuzi9:
呃，跑题了，谢谢ls的热情相助，同做生物，欢迎交流探讨，可能我问的会比较多，不要嫌弃~:tuzi15: : Originally posted by 麦堂straw at
嗯，是这样说的，最近网上不流传一篇文章，叫《水喝多了，尿自然就有了》，大意就是看的多了，做的多了，论文也就有了，好期待那一天:tuzi9:
呃，跑题了，谢谢ls的热情相助，同做生物，欢迎交流探讨，可能我问的会 ... 互相学习进步了，呵呵。这几天被毕业论文搞得焦头烂额！:tuzi17: : Originally posted by 山水老流氓 at
互相学习进步了，呵呵。这几天被毕业论文搞得焦头烂额！:tuzi17:... 熬一熬就解放了，然后睡3天，O(∩_∩)O哈哈~
每天登一登小木虫，心情更舒畅:tuzi26:
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